摘 要：以刺梨為原料，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定出刺梨果酒酒精發(fā)酵的最優(yōu)工藝條件，并利用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Headspace Solid Phase Micro Extraction Gas Chromatography Mass Spectrometry，HS-SPME-GC/MS）測(cè)定刺梨果酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。結(jié)果表明，刺梨果酒的最佳工藝條件為干酵母添加量0.10%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間8 d，由此工藝條件發(fā)酵的刺梨果酒在酒精度和感官品質(zhì)上都表現(xiàn)優(yōu)異。用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）共鑒定出了40種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類(lèi)20種、醇類(lèi)10種、醛類(lèi)7種、其他類(lèi)3種。本研究為工業(yè)化液態(tài)發(fā)酵刺梨果酒以及刺梨果酒的特征香氣物質(zhì)研究提供一定的理論參考。

關(guān)鍵詞：刺梨；發(fā)酵；頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC/MS）；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

Fermentation Process Optimization and Volatile Flavor Substances Analysis of Rosa roxburghii Wine

ZHANG Lifang， YANG Rui， YE Xin， MOU Rang*

（Inspection and Testing Center of Lichuan， Enshi 445400， China）

Abstract： Using Rosa roxburghii as the raw material， the optimal process conditions for alcohol fermentation of Rosa roxburghii fruit wine were determined through orthogonal experiments， and the volatile flavor compounds in Rosa roxburghii fruit wine were determined using headspace solid phase micro extraction gas chromatography mass spectrometry （HS-SPME-GC/MS） technology. The results showed that the optimal process conditions for Rosa roxburghii fruit wine were a dry yeast addition of 0.10%， a fermentation temperature of 28 ℃， and a fermentation time of 8 days. The Rosa roxburghii fruit wine fermented under these process conditions exhibited excellent alcohol content and sensory quality. 40 volatile flavor compounds， including 20 esters， 10 types of alcohols， 7 types of aldehydes， and three other categories were identified using gaschromatography-mass spectrometry （GC-MS） technology. This study provides a theoretical reference for the industrial liquid fermentation of Rosa roxburghii fruit wine and the study of characteristic aroma compounds in Rosa roxburghii fruit wine.

Keywords： Rosa roxburghii; fermentation; headspace solid phase micro extraction gas chromatography mass spectrometry（HS-SPME-GC/MS）; volatile flavor substances

刺梨（Rosa roxburghii）為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實(shí)[1]，這種果實(shí)的成熟果皮上生長(zhǎng)著小肉刺，并且包裹著種子，故稱(chēng)為“刺梨”。刺梨營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多糖、黃酮、氨基酸等，其中果實(shí)內(nèi)含有豐富的維生素C，被稱(chēng)為“維C之王”[2]。在低酒精度環(huán)境中，刺梨中的一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、礦物質(zhì)等仍能得到保留[3]。同時(shí)，刺梨具有多種保健作用，包括調(diào)節(jié)人體新陳代謝、促進(jìn)血液循環(huán)、控制膽固醇水平、抗衰老及增強(qiáng)抵抗力等[4]。

近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高以及健康意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)于飲酒的選擇逐漸從高度酒向低度酒轉(zhuǎn)移，而具有保健作用的果酒更是受到越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞。果酒是以人工種植或野生的果品為原料，經(jīng)過(guò)一系列工序進(jìn)行發(fā)酵的一種低酒精度飲料。大部分常見(jiàn)水果，如葡萄、蘋(píng)果、桑葚、藍(lán)莓等，都能夠用于果酒釀造[5]。由于刺梨汁中的單寧、總酸含量較高，使得其在發(fā)酵過(guò)程中存在發(fā)酵周期長(zhǎng)，產(chǎn)品酒精度偏低，糖度高以及易氧化褐變并產(chǎn)生氧化味等問(wèn)題，這在一定程度上阻礙了刺梨果酒的發(fā)展[6]。目前利用刺梨進(jìn)行果酒釀造過(guò)程中，研究人員主要關(guān)注發(fā)酵過(guò)程中各類(lèi)功能性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的變化情況[7]，以及微生物對(duì)發(fā)酵底物的利用程度[8]，而缺乏對(duì)整個(gè)酒體協(xié)調(diào)性和香氣物質(zhì)的研究。目前研究風(fēng)味物質(zhì)最常用的方法是頂空固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、萃取效率高以及樣品預(yù)處理步驟少，且能高效地提取出風(fēng)味物質(zhì)并進(jìn)行鑒定，被廣泛應(yīng)用于葡萄酒、果酒等風(fēng)味的研究[9]。

本研究對(duì)刺梨在液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用頂空固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用相結(jié)合的方法，分析果酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，以期為工業(yè)化液態(tài)發(fā)酵刺梨果酒研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨，無(wú)霉變腐爛的野生鮮果，購(gòu)自貴州??；酵母，安琪葡萄酒果酒專(zhuān)用酵母，湖北安琪酵母股份有限公司；液體型果膠酶（酶活≥30 000 U·mL-1），寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；蔗糖、偏重亞硫酸鈉、乳酸等，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)；2-辛醇，色譜純，Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ9610三重四極桿氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀，Thermo Fisher Scientific公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國(guó)Supelco公司；MJX-100B-Z恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 刺梨果酒釀造工藝流程

選用成熟、完好的刺梨果進(jìn)行酒精發(fā)酵，具體工藝路線如圖1所示。

1.3.2 刺梨果酒釀造主要操作要點(diǎn)

（1）去核。去掉刺梨果前端的宿存花萼，將果實(shí)對(duì)半剖開(kāi)，刮掉內(nèi)部種子，只留果肉備用。

（2）打漿。定量稱(chēng)取處理好的刺梨果，置于粉碎機(jī)中打碎，然后將粉碎后的刺梨漿置于2 L干凈燒杯中，攪拌均勻。

（3）酶解。向裝有刺梨漿的燒杯中加入適量無(wú)菌水，充分?jǐn)嚢瑁缓蠹尤?00 mg·L-1偏重亞硫酸鈉，并用食品級(jí)乳酸調(diào)節(jié)pH值在4.5～5.0，加入0.05%刺梨質(zhì)量的果膠酶，在50 ℃下酶解40 min，過(guò)濾。

（4）調(diào)配。向過(guò)濾得到的刺梨汁中加入蔗糖，用乳酸調(diào)整pH值在4.0左右，然后分裝到三角瓶中。

（5）發(fā)酵。稱(chēng)取一定量干酵母，用含2%糖的38 ℃溫開(kāi)水活化20 min，將活化的酵母接種到刺梨汁中，用紗布將發(fā)酵瓶封口，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，于28 ℃下進(jìn)行酒精發(fā)酵。

1.3.3 酒精發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，以酒精含量為判定指標(biāo)，選擇酵母添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）3個(gè)因素，進(jìn)行3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)刺梨酒精發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，正交實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

1.3.4 理化指標(biāo)測(cè)定

酒精度的測(cè)定參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酒和食用酒精中乙醇濃度的測(cè)定》（GB 5009.225—2023）的測(cè)定方法進(jìn)行[10]。

1.3.5 刺梨果酒感官評(píng)價(jià)

刺梨果酒的感官鑒評(píng)方法參考賀紅早等[11]的方法，略有改動(dòng)。選擇5名實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)刺梨果酒進(jìn)行感官評(píng)定，主要從外觀、色澤、香氣、口味和風(fēng)格5個(gè)方面對(duì)刺梨果酒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)并打分，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

1.3.6 刺梨果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

按照黃桂東等[12]的提取和測(cè)定方法，略有變動(dòng)。

（1）頂空固相微萃取處理?xiàng)l件。取4 mL過(guò)濾后的澄清發(fā)酵液，加入到20 mL頂空瓶中，再加入1.0 g NaCl和20 μL內(nèi)標(biāo)（2-辛醇，調(diào)整濃度為8 800 μg·L-1），使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在50 ℃下預(yù)熱15 min，萃取吸附40 min，250 ℃解吸7 min，用于上機(jī)分析。

（2）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀處理?xiàng)l件。①氣相色譜條件。色譜柱：TG-WAXMS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣（純度＞99.999%），不分流；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min，以6 ℃·min-1升溫至100 ℃，然后以10 ℃·min-1升溫至230 ℃，保持7 min。②質(zhì)譜條件。離子源：EI源；發(fā)射電流：50 μA；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；掃描質(zhì)量范圍：33～400 amu。

（3）定量分析方法。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行。該方法基于被檢測(cè)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物濃度與吸收峰面積對(duì)應(yīng)的比例關(guān)系，計(jì)算被檢測(cè)組分的含量。計(jì)算公式為

（1）

式中：Cx代表被檢測(cè)物質(zhì)濃度，mg·L-1；Cs代表內(nèi)標(biāo)物濃度，mg·L-1；Ax代表被檢測(cè)物質(zhì)峰面積；As代表內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

未知化合物通過(guò)與NIST20譜庫(kù)和化學(xué)結(jié)構(gòu)式庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)計(jì)算保留指數(shù)（Retention Index，RI）確認(rèn)。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016、SPSS Statistics 21.0等軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化

酒精發(fā)酵過(guò)程中，酵母在厭氧環(huán)境下可以直接利用糖分產(chǎn)生乙醇。酵母的濃度對(duì)發(fā)酵液中糖的利用度以及乙醇的產(chǎn)生有影響，主要體現(xiàn)在濃度越高，產(chǎn)生的乙醇越快。然而，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到一定水平后，它又會(huì)抑制酵母的生長(zhǎng)；在一定溫度范圍內(nèi)，微生物的生長(zhǎng)速率隨著溫度的升高而加快，但超過(guò)最適溫度則會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)；隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，糖分的減少、乙醇濃度的增加，導(dǎo)致酒精含量變化速率呈現(xiàn)先升高后變緩趨勢(shì)。因此，酵母添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)刺梨果酒酒精發(fā)酵過(guò)程有著重要的影響作用。本研究根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)。由表3可知，影響刺梨發(fā)酵產(chǎn)酒精的因素主次順序?yàn)榻湍柑砑恿浚景l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間（A＞B＞C）。刺梨果酒的最佳釀造條件為A2B3C1，即在干酵母添加量為0.10%、發(fā)酵溫度為28 ℃、發(fā)酵時(shí)間為8 d條件下，刺梨果酒的酒精度最高。將同批次的鮮刺梨果經(jīng)打漿、過(guò)濾、調(diào)配等處理后得到預(yù)發(fā)酵液，然后在發(fā)酵液中添加0.10%干酵母，并于28 ℃溫度下發(fā)酵8 d，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)得酒精含量為8.7%vol，與預(yù)測(cè)值基本一致。

2.2 刺梨果酒產(chǎn)品感官鑒評(píng)

將最佳釀造條件下得到的發(fā)酵果酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。結(jié)果見(jiàn)表4。從感官評(píng)價(jià)結(jié)果來(lái)看，刺梨果酒平均得分為87分，發(fā)酵結(jié)束后的果酒外觀澄清透明、晶亮，有極少量沉淀，顏色呈琥珀色，與刺梨果實(shí)特有的顏色相似，酒香和水果香突出，口味較為醇和，具有刺梨果酒產(chǎn)品特有的風(fēng)味。

2.3 刺梨果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)果酒的風(fēng)味和風(fēng)格等起著決定性的作用。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）對(duì)刺梨果酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定。由表5可知，在刺梨果酒發(fā)酵液中共檢測(cè)出40種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類(lèi)20種、醇類(lèi)10種、醛類(lèi)7種、其他類(lèi)3種。酯類(lèi)中主要的香氣物質(zhì)為亞油酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸乙酯和辛酸乙酯，酯類(lèi)多是具有芳香和水果香氣的物質(zhì)，賦予果酒特有的香氣風(fēng)格；醇類(lèi)中主要香氣物質(zhì)為異戊醇、苯乙醇和異丁醇等，這幾種都屬于高級(jí)醇，也是果酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，能夠增加果酒的醇香味，如果缺失則會(huì)導(dǎo)致酒味淡薄，酒體不豐滿，這與用其他水果釀造的發(fā)酵果酒較為一致[13]。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了刺梨果酒發(fā)酵工藝，得出的最佳工藝條件為干酵母添加量0.10%，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 d，此時(shí)果酒的酒精度達(dá)到最高，為8.8%vol。采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)刺梨果酒發(fā)酵液中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，共檢測(cè)出40種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類(lèi)20種、醇類(lèi)10種、醛類(lèi)7種、其他類(lèi)3種。其中，主要香氣物質(zhì)為異戊醇和苯乙醇。未來(lái)，研究人員還需繼續(xù)優(yōu)化儀器的分析條件，以便能夠?qū)Υ汤婀频娘L(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行更加準(zhǔn)確的分析。

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