摘要" 為探究鹽度馴化對許氏平鲉鈉鉀ATP酶（NKA）活性及鰓中AQP3基因表達量的影響，將140尾該魚分為急性鹽度馴化和慢性鹽度馴化兩部分試驗。急性鹽度馴化將其放入鹽度為32、27、24、21、18、15、12和9的試驗組中進行鹽度脅迫，取鰓、腸及腎組織樣測定NKA活性；慢性鹽度馴化將其放入鹽度為32、25、20、15、10和5的試驗組中進行鹽度脅迫，取鰓組織樣測定AQP3的表達量。急性鹽度馴化結(jié)果表明，除對照組外，鰓中NKA活性均明顯高于腸和腎中NKA的活性（Plt;0.05），各個鹽度組中腸和腎中NKA的活性差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。慢性鹽度馴化結(jié)果顯示，在鹽度脅迫達到4"h時，AQP3的表達量在25‰和20‰組出現(xiàn)峰值，隨著鹽度下降，表達量也隨之下降；96"h時25‰組AQP3表達量逐漸恢復(fù)，而20‰組表達量仍為峰值，而后隨鹽度下降逐漸下降。綜上，許氏平鲉可通過NKA和AQP3調(diào)節(jié)機體的滲透壓平衡。

關(guān)鍵詞" 許氏平鲉；鹽度脅迫；Na+，K+-ATPase；AQP3基因

中圖分類號" S965.399"""""" 文獻標識碼" A"""""" 文章編號" 1007-7731（2024）22-0036-07

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.22.009

基金項目 遼寧省教育廳高等學?；究蒲许椖浚↗YTZD2023038）。

作者簡介 化文原（1997—），男，河南周口人，碩士研究生，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖生物繁育研究。

通信作者 陳巖（1976—），男，吉林人，博士，講師，從事魚類生物學研究。

收稿日期 2024-04-15

Effects of salinity acclimation on Na+，K+-ATPase activity and AQP3"gene expression in gill of Sebastes schlegelii

HUA Wenyuan""" YOU Yuzhuo""" ZHANG Yaming""" SUN Rongzhen""" DING Ye""" ZHANG Yunuo WANG Wei""" CHEN Yan

（Key Laboratory of Applied Biology and Aquaculture of Northern Fishes in Liaoning Province， Dalian Ocean University， Dalian 116023， China）

Abstract" To investigate the effects of salinity acclimation on NKA （Na+，K+-ATPase） activity and gill AQP3"gene expression of 140 Sebastes schlegelii.The experiment was divided into two parts： acute salinity acclimation and chronic salinity acclimation. They were subjected to salinity stress in experimental groups with acute salinity of 32， 27， 24， 21， 18， 15， 12"and 9. NKA activity in gill， intestine and kidney were measured. In chronic salinity acclimation， it was placed in experimental groups with salinities of 32， 25， 20， 15， 10"and 5 for salinity stress， and the expression of AQP3 in the gill was measured. The results of acute salinity acclimation showed that NKA activity in gill was significantly higher than that in intestine and kidney except control group （Plt;0.05）， there was no statistical significance in NKA activity in midintestine and kidney in all salinity groups （Pgt;0.05）. The results of chronic salinity acclimation showed that AQP3 expression peaked in 25‰ and 20‰ groups when salinity stress reached 4"h， and decreased with the decrease of salinity. At 96"h， the expression of AQP3 in the 25‰ group gradually recovered， while the expression of AQP3 in the 20‰ group was still at its peak， and then gradually decreased with the decrease of salinity. In conclusion， the Sebastes schlegelii could regulate the osmolality of the body through NKA and AQP3.

Keywords" Sebastes schlegelii; salinity stress; Na+，K+-ATPase; AQP3"gene

許氏平鲉（Sebastes schlegelii）隸屬脊索動物門（Chordata）、硬骨魚綱（Osteichyes）鲉形目（Scorpaeniformes）鲉科（Scorpaenidae）平鲉屬（Sebastes），是重要的近海經(jīng)濟魚類之一。該魚喜棲息在巖礁地帶的淤泥質(zhì)底層，無長距離洄游習性；小型個體多分布于沿海，大型個體則常棲息在海水顏色較暗、流速較急等地。目前對于許氏平鲉的研究主要在基礎(chǔ)生物學[1-3]，消化及組織化學[4]，環(huán)境脅迫[5-6]和營養(yǎng)需求[7-8]等方面。

楊宇晴等[9]研究表明，鰓中三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）酶、離子濃度與血漿滲透壓是評價魚體滲透壓調(diào)節(jié)的重要指標，在維持機體滲透調(diào)節(jié)平衡與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定上起主要作用。鈉鉀ATP酶（Na+， K+-ATPase，NKA）是進行滲透調(diào)節(jié)重要的蛋白酶之一，在滲透壓調(diào)節(jié)過程中NKA通過泵出Na+吸收K+，形成細胞內(nèi)外電位勢，啟動二級膜蛋白運輸及離子通道，以維持體內(nèi)穩(wěn)定的滲透壓。陳利瓊等[10]綜述了水通道蛋白3（Aquaporins 3，AQP3）的研究進展，表明水通道蛋白AQPs是一類特異性轉(zhuǎn)運水的蛋白家族，能明顯增加細胞膜對于水的通透性，參與水的分泌、吸收以及細胞內(nèi)外平衡調(diào)節(jié)等過程。AQP3是水通道蛋白家族成員之一，對水和甘油等小分子物質(zhì)具有通透性[11]。Sato等[12]研究表明，暴露在亞硝酸鹽中的平鯛（Rhabdosargus sarba）AQP3的表達在鰓中無變化，但在腎中表達量明顯下降，NKA活性有一定增加，另外HSP70/90活性增加。

本試驗選取許氏平鲉作為研究對象，研究其在不同鹽度變化下的適應(yīng)性、相應(yīng)滲透壓調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶的活性變化以及相關(guān)基因的表達調(diào)控，為海水魚淡化養(yǎng)殖的鹽度馴化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

許氏平鲉采自大連市旅順口區(qū)附近海域，打撈后經(jīng)過打氧充氣直接從碼頭運回大連海洋大學遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學及增養(yǎng)殖重點實驗室進行暫養(yǎng)，實驗室養(yǎng)殖水體環(huán)境溫度為（24±0.5）℃，溶氧gt;5"mg/L，pH 7.9～8.3，光照300～1 000 lx，氨氮lt;0.1"mg/L，亞硝酸鹽lt;0.01"mg/L。在實驗室條件下暫養(yǎng)7"d，暫養(yǎng)期間每天上午8：00投喂一次，飼料投喂量為魚體體重的2%～3%，每日換50%水，用吸管吸出未消化的殘餌及糞便，保證養(yǎng)殖水體清潔。試驗用水經(jīng)消毒、過濾、沉淀并充分曝氣后使用。低鹽度海水由充分曝氣后的自來水（鹽度為0）和沙濾海水（鹽度為32）調(diào)配而成。換水前1"d將水調(diào)整至所需的鹽度并充分曝氣備用。在試驗期間保證飼養(yǎng)環(huán)境下的水溫以及光照符合許氏平鲉的正常生長，對其生命力不造成影響。經(jīng)暫養(yǎng)后選取140尾生長狀態(tài)良好健康的許氏平鲉進行試驗，魚體質(zhì)量（94.32±6.41）g，體長（19.13±1.32）cm。

1.2 試驗設(shè)計

試驗開始前進行急性鹽度馴化條件下許氏平鮋的半致死濃度的測定[13]?；诎胫滤罎舛?，本試驗共分為兩部分進行。一部分為急性鹽度馴化試驗，另一部分為慢性鹽度馴化試驗，兩部分試驗在各自獨立的環(huán)境下進行，互不干擾。在急性鹽度馴化試驗中，取80尾暫養(yǎng)的許氏平鲉，將其隨機分成8組，每組10尾魚，飼養(yǎng)在鹽度不同的水槽中，其中1組為海水對照組（鹽度為32），試驗鹽度設(shè)8個梯度，分別為32、27、24、21、18、15、12和9，并取樣。在慢性鹽度馴化試驗中，取60尾暫養(yǎng)的許氏平鲉，將其隨機分成6組，每組10尾魚，分別飼養(yǎng)在6個水槽中，其中1組為海水對照組（鹽度為32）；慢性鹽度馴化梯度為32、25、20、15、10和5，慢性鹽度馴化每天每個試驗組降低1‰到試驗設(shè)置的鹽度，降低至所需梯度后取樣并進行相關(guān)指標的測定。

馴化結(jié)束后，每個平行選取3尾，分別于4、12、24、48和96"h取樣。急性鹽度馴化取樣時，使用丁香酚麻醉，解剖工作在0"℃環(huán)境下完成；快速取其鰓、腸及腎組織，用生理鹽水洗滌，放入凍存管中，在液氮中進行速凍，然后放入-80"℃冰箱保存。慢性鹽度馴化只取其鰓組織，使用PBS緩沖液洗滌，置于核糖核酸（RNA）組織保存液中，放入-80"℃冰箱保存。以供日后提取總RNA使用。

1.3 測定指標和方法

1.3.1 NKA活性測定 取樣后的組織經(jīng)過生理鹽水洗滌后，除去血液，使用濾紙拭干，稱重，放入玻璃勻漿器內(nèi)，按重量（g）∶體積（mL）為1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，在冰浴條件下進行勻漿。將制成的10%勻漿液1 000 r/min離心5"min后，取上清液，一部分用于蛋白濃度測定，一部分用于酶活性檢測。蛋白濃度檢測試劑盒和NKA活性測定試劑盒均由由南京建成生物工程研究所提供。NKA活性的定義為每小時每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解1 μmol無機磷的量為一個ATP酶活力單位。涉及的計算公式如式（1）～（2）。

待測樣本蛋白濃度=［（測定OD－對照OD）÷（標準OD－空白OD）］×標準品濃度×稀釋倍數(shù)"""""" （1）

組織酶活力=［（測定OD－對照OD）÷（標準OD－空白OD）］×標準品濃度×6×7.8÷待測樣本蛋白濃度""" （2）

1.3.2 RNA提取和熒光定量PCR 組織總RNA用天根生化科技有限公司提供的RNA提取試劑盒（DP431）提取，用凝膠電泳檢測RNA的完整性，用NanoDrop 2000測定其濃度和質(zhì)量。完整性較好的RNA用天根生化科技有限公司提供的RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（KR116-02）進行cDNA合成，合成產(chǎn)物稀釋后放入–80"℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)Genbank中魚類AQP3的基因序列，利用DNAMAN軟件進行多序列比較，用Primer 5.0軟件設(shè)計許氏平鲉PCR引物，進行PCR擴增，然后進行膠回收，測序，分析得到許氏平鲉AQP3的基因序列，設(shè)計其熒光定量PCR引物。引物由上海英俊公司合成，選取β-actin作為內(nèi)參，引物具體序列如表1所示。

先進行常規(guī)PCR反應(yīng)，以確保引物可以擴增出目的條帶，然后再進行熒光定量PCR反應(yīng)。常規(guī)PCR反應(yīng)條件：95"℃預(yù)變性4"min；35個循環(huán)：95"℃變性15～30"s，55～65"℃退火15～30"s，72"℃延伸30"s；循環(huán)結(jié)束后72"℃延伸5～10"min。熒光定量PCR條件：95"℃預(yù)變性2～5"min；40個循環(huán)：95"℃變性15～30"s，60"℃退火15～30"s，72"℃延伸30"s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以3個平行組數(shù)據(jù)的平均值±標準差（Means±SD）表示，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan多重比較進行組間差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 半致死濃度

在本實驗室之前的研究基礎(chǔ)上可知[13]，許氏平鲉在4～30的鹽度內(nèi)生存良好，當鹽度降至3（包括3）以下時開始出現(xiàn)死亡，在鹽度為0的條件下，6"h內(nèi)試驗魚全部死亡。當鹽度為3時，96"h內(nèi)不同時間的半致死鹽度見表2。表明本試驗設(shè)置的鹽度對其生長較安全。

2.2 鰓、腸及腎中NKA活性

如圖1所示，各處理鹽度組腸和腎中NKA的活性差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），但明顯低于對照組（鹽度32）（Plt;0.05）；腸和腎中的NKA活性不高，均低于鰓中NKA活性。鰓中NKA活性總體趨勢為隨著鹽度的降低先略微升高再降低，然后又升高后趨于穩(wěn)定，在鹽度為21時出現(xiàn)峰值。表明急性鹽度馴化中，相比較于腸和腎，鰓中NKA活性變化較大。鰓是鹽度馴化發(fā)揮作用的主要器官之一，隨著鹽度的降低，鰓中NKA活性不斷發(fā)生變化，鹽度21是鰓能主動適應(yīng)且自身不受損傷的鹽度。

同一欄內(nèi)不同小寫字母表示處理間差異具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。

2.3 總RNA質(zhì)量

提取的許氏平鲉鰓組織中的總RNA用瓊脂糖凝膠電泳對其大小和完整性進行檢測，結(jié)果如圖2所示，電泳結(jié)果可見28S、18S和5.8S三條清晰的電泳帶，用紫外分光光度計測其純度，其A260/A280在1.9～2.1，說明其總RNA純度較高，可以直接作為反轉(zhuǎn)錄的模板。

如圖3所示，3個引物的電泳條帶單一，清晰，無引物二聚體，說明TAQP3、β-actin和AQP3引物特異性良好，可用于后續(xù)熒光定量PCR。

M為Marker；泳道1～6分別代表鹽度5～32的RNA樣本。

M為Marker；泳道1為TAQP3；泳道2為AQP3；泳道3為β-actin。

2.4 AQP3表達量

2.4.1 鹽度脅迫4"h 如圖4所示，在鹽度下降的過程中，鹽度脅迫達到4"h時，AQP3的表達量在25和20鹽度時較高，分別是2.612和2.582，之后隨著鹽度的下降，表達量也隨之下降，最后恢復(fù)至對照組水平。表明在短時間內(nèi)當鹽度在一定范圍內(nèi)降低時，其AQP3表達量升高，有利于促進水分排出，維持體內(nèi)滲透壓平衡；在鹽度較低的環(huán)境中，鰓上皮對水的通透性高，大量水分進入魚體內(nèi)，鰓上皮細胞AQP3可將由細胞頂端進入的水從基底側(cè)排出，有利于自身滲透壓的調(diào)節(jié)。因此，增加AQP3的表達量能促進水分的排出，可防止上皮細胞膨脹破裂，維持體內(nèi)滲透平衡。

2.4.2 鹽度脅迫96"h 如圖5所示，當鹽度脅迫時間達到96"h時，與4"h鹽度脅迫相比，25鹽度組的AQP3基因表達量有所下降，而20鹽度組的基因表達量升高至3.276，仍為峰值。隨著鹽度的下降，基因表達量驟減至對照組以下水平，然后趨于穩(wěn)定。表明鰓作為與水環(huán)境直接接觸的滲透調(diào)節(jié)器官，當水環(huán)境鹽度發(fā)生變化時，最先響應(yīng)鹽度脅迫進行滲透調(diào)節(jié)，以維持魚體滲透壓穩(wěn)定。鹽度在一定范圍內(nèi)變化時，許氏平鲉可經(jīng)過自身調(diào)節(jié)維持滲透壓平衡。當水環(huán)境鹽度劇烈變化時，滲透壓調(diào)節(jié)失衡，魚體開始出現(xiàn)嚴重損傷。

3 結(jié)論與討論

3.1 急性鹽度馴化對不同組織NKA活性的影響

魚類可從環(huán)境中攝取或從自身排出多余的離子來適應(yīng)環(huán)境中鹽度的變化，從而維持整個機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，NKA是發(fā)揮離子調(diào)節(jié)作用的主要活性酶之一[14]。近幾年有較多學者研究魚類急性鹽度馴化下NKA活性的變化，如褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）[15]、軍曹魚（Rachycentron canadum）[16]和條石鯛（Oplegnathus fasciatus）等，以上研究表明，外界環(huán)境鹽度的變化會對NKA活性產(chǎn)生明顯影響。本試驗發(fā)現(xiàn)鰓中NKA的活性高于腸和腎，這表明NKA主要分布在鰓上，此結(jié)果與Evans等[17]研究結(jié)果一致。Cutler等[18]和Kim等[19]研究指出，NKA在腸和腎中的活性不高，可能是因為其有關(guān)基因表達量在這兩種組織中不高，導(dǎo)致其調(diào)節(jié)功能有限。

Shui等[20]和Jensen等[21]研究表明，當魚體的環(huán)境鹽度劇烈變化后，魚鰓中的NKA的活性隨著鹽度的變化呈現(xiàn)“U”形的變化趨勢，即在對照組和低鹽度組的NKA活性高于中間梯度組。同樣的趨勢在褐牙鲆[15]的實驗中也有所體現(xiàn)，可能是魚體內(nèi)存在一個等滲點，使魚類的鰓中NKA活性有一個最低值，魚體不需要過多的NKA來進行自身的離子調(diào)節(jié)[22-23]。蒲春霞[24]研究表明，NKA也可進行水的調(diào)節(jié)，因此在低鹽度下NKA的活性上升可能是參與組織排水的調(diào)節(jié)過程[25]。本試驗中，許氏平鲉鰓中低鹽度組NKA活性高于對照組的原因可能是因為過低的鹽度刺激NKA使其活性增加，進而調(diào)節(jié)滲透壓，使魚體的滲透壓保持在正常水平。成智麗等[13]研究了鹽度馴化下許氏平鲉血清生化指標及滲透壓的變化，發(fā)現(xiàn)鹽度在9～32的梯度內(nèi)，血清中的滲透壓無明顯差異，可能是NKA的調(diào)節(jié)機制，使許氏平鲉體內(nèi)滲透壓在處于鹽度馴化的時期依然保持穩(wěn)定水平。不同魚種對鹽度變化的離子調(diào)節(jié)機制不盡相同，其離子調(diào)節(jié)機制比較復(fù)雜[26]，關(guān)于鰓與腸和腎等器官進行聯(lián)合離子調(diào)節(jié)有待進一步研究。

3.2 慢性鹽度馴化對鰓中AQP3基因表達量的影響

鹽度會影響鰓、腎臟和消化道（主要滲透調(diào)節(jié)器官）中水通道蛋白的表達水平。目前關(guān)于硬骨魚AQP3基因的研究較多，其中歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）[18]、莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）[11]和加拿大底鳉魚（fundulus heteroclitus）[27]等已經(jīng)有AQP3 cDNA序列被成功克隆，并研究其結(jié)構(gòu)和功能。甘遠迪等[28]使用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同鹽度脅迫下薩羅羅非魚（Sarotherodon melanotheron）各組織中AQP3"mRNA的表達量，結(jié)果顯示AQP3在各個組織中均有一定的表達，其中皮膚、鰓和肌肉組織的表達量明顯高于其他組織。相似的結(jié)果在Tse等[29]研究中也有體現(xiàn)。在其他廣鹽性魚類中，AQP3也被證實大量存在于氯細胞中[30]。AQP3現(xiàn)已在許多不同的硬骨魚物種中被鑒定出來，基因組數(shù)據(jù)庫中還提供了更多魚類該基因的DNA序列信息。在硬骨魚鰓中，AQP3在氯細胞中表達，在一些物種中，還存在于其他上皮細胞中，具有防止細胞脫水等功能[31]。本試驗通過對許氏平鲉進行鹽度脅迫，發(fā)現(xiàn)鰓組織中AQP3基因的表達量隨著鹽度的降低出現(xiàn)變化，當鹽度下降時，該基因的表達量上升，這一結(jié)果與甘遠迪等[28]和Giffard-Mena等[32]研究結(jié)果基本一致。原因可能是當鰓組織直接接觸到低滲環(huán)境的海水時，魚類會面臨滲透梯度較大而產(chǎn)生的高通量水分子流的風險，通過增加AQP3的表達量可以促進水分的排出，防止細胞膨脹破裂，以維持體內(nèi)滲透壓的平衡[33-34]。

通過對比不同鹽度脅迫時間AQP3表達量的差異，發(fā)現(xiàn)與脅迫4"h相比，96"h時鹽度為25的該基因表達量有所恢復(fù)。表明在此鹽度水平下，許氏平鲉在進行了短暫的離子調(diào)節(jié)之后體內(nèi)滲透壓逐漸恢復(fù)了正常水平。張金生等[25]在大菱鲆（Scophthalmus maximus）水通道蛋白AQP1和AQP3以及離子通道蛋白對低鹽脅迫的響應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)，AQP3表達量隨時間呈現(xiàn)先升后降的趨勢。本研究中當鹽度降低到20，脅迫時間從4"h到96"h時，AQP3表達量增加，可能是96"h不足以使體內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)至正常水平，故在96"h后仍在繼續(xù)進行滲透調(diào)節(jié)。張金生等[25]研究發(fā)現(xiàn)，更低的鹽度需要更長的時間，更多的基因表達量來進行機體滲透調(diào)節(jié)。An等[35]在有關(guān)黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）的AQP1研究中指出，低滲環(huán)境能促進其鰓和腎的水通道蛋白調(diào)節(jié)，而腸的水通道蛋白調(diào)節(jié)不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽度低于20的脅迫下，AQP3基因表達量均不高，可能是因為鹽度過低，導(dǎo)致了一定程度的鹽度調(diào)節(jié)失衡，滲透壓調(diào)節(jié)機制受到抑制；但鰓上NKA的活性一直明顯高于對照組，表明機體的滲透壓調(diào)節(jié)仍在繼續(xù)，但主要排水的部位可能轉(zhuǎn)移到腸或腎等器官。

綜上，本試驗研究了鹽度馴化對許氏平鲉NKA活性及鰓中AQP3基因表達量的影響，發(fā)現(xiàn)許氏平鲉主要通過鰓來進行鹽度馴化下的滲透壓調(diào)節(jié)，鰓中該基因表達量呈現(xiàn)先增加后降低最后趨于平緩趨勢，不同的鹽度馴化水平?jīng)Q定整個進程的長短；許氏平鲉可通過NKA活性和AQP表達量調(diào)節(jié)機體的滲透壓平衡。

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（責任編輯：胡立萍）