摘要" 為探究寬體金線蛭腸道與土壤環(huán)境中細(xì)菌群落多樣性差異，本研究使用高通量測序技術(shù)測定了該物種腸道和土壤中的細(xì)菌群落。結(jié)果表明，金線蛭腸道和土壤樣品中的細(xì)菌群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，表明土壤對腸道細(xì)菌群落的建立影響不大。與土壤樣品相比，腸道樣品中的細(xì)菌豐富度和多樣性明顯降低；腸道中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes）40.64%、變形桿菌（Proteobacteria）28.94%和擬桿菌門（Bacteroidota）16.20%等，土壤中的優(yōu)勢菌門為變形桿菌48.95%、擬桿菌門16.69%和放線菌門（Actinobacteriota）14.85%等；腸道中優(yōu)勢屬為氣單胞菌屬（Aeromonas）23.76%、鯨桿菌屬（Cetobacterium）9.98%和刺骨魚屬（Epulopiscium）8.16%。土壤類群中優(yōu)勢屬為氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga）6.16%、黃桿菌屬（Flavobacterium）11.36%和氣單胞菌屬5.26%。兩者在轉(zhuǎn)運(yùn)通路、碳循環(huán)通路和免疫等方面存在差異。研究結(jié)果為了解寬體金線蛭的腸道細(xì)菌群落及與土壤環(huán)境間的關(guān)系提供參考。

關(guān)鍵詞" 寬體金線蛭；腸道菌群；土壤菌群；菌群多樣性

中圖分類號" S917.4" " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼" A" " " "文章編號" 1007-7731（2024）23-0035-05

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.23.008

Analysis of intestinal flora diversity of Whitmania pigra in Yellow River Delta

LIANG Zhaodong" " CUI Qinghua

（Binzhou Environmental Protection Science and Technology Institute， Binzhou 256600， China）

Abstract" To investigate the diversity of bacterial communities in the intestinal tract of Whitmania pigra and soil of enviroment， high-throughput sequencing technology was used to determine the bacterial communities in the intestinal tract of this species.and soil of enviroment The results showed that there were significant differences in bacterial community diversity between and community structure intestinal and soil samples，indicated that soil had little effect on the establishment of intestinal bacterial community. Compared with soil samples， the richness and diversity of bacteria in intestinal samples were significantly reduced. The dominant bacteria in the gut were Firmicutes 40.64%， Proteobacteria 28.94% and Bacteroidota 16.20%. The dominant bacteria in soil were Proteobacteria 48.95%， Bacteroides 16.69% and Actinobacteriota 14.85%. The dominant genera were Aeromonas 23.76%， Cetobacterium 9.98% and Epulopiscium 8.16%. The dominant genera of the soil groups were Hydrogenophaga 6.16%， Flavobacterium 11.36% and Aeromonas 5.26%. There were differences in transport pathway， carbon cycle and immunity between the two. The research results provided a reference for understanding the relationship between intestinal bacterial community of Whitmania pigraand and soil environment .

Keywords" Whitmania pigra; intestinal flora; soil flora; bacterial diversity

腸道微生物及其代謝產(chǎn)物在宿主的一系列生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用，如營養(yǎng)和能量獲取、免疫和炎癥調(diào)節(jié)以及神經(jīng)傳導(dǎo)等[1-2]。寄主系統(tǒng)發(fā)育、生長、飲食和健康狀況對腸道細(xì)菌群落的組成和多樣性有一定的影響[3-4]。外部環(huán)境中的微生物有助于動(dòng)物腸道微生物群落的建立。Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，土壤無脊椎動(dòng)物的腸道微生物是由土壤微生態(tài)帶逐漸建立而成。微生物群落分析通常采用分離培養(yǎng)法，但這種方法從樣品中分離出微生物有限，因此較難準(zhǔn)確地計(jì)算出微生物的數(shù)量[6]。嚴(yán)瓊英等[7]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳和16S rDNA技術(shù)進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析，得出的結(jié)果較完整。劉驍蒨等[8]分析了變性梯度凝膠電泳技術(shù)在馬屬動(dòng)物腸道微生物多樣性研究中的應(yīng)用，表明該技術(shù)在分析動(dòng)物腸道微生物多樣性方面具有快速、精確等優(yōu)點(diǎn)，是篩選優(yōu)勢菌株和分離有害菌的有效手段之一。隨著測序技術(shù)不斷發(fā)展，高通量測序成為反映樣品中微生物信息的有效工具之一。

大多數(shù)水蛭生活在淡水環(huán)境中，部分物種可以在陸地和海洋環(huán)境中生存。其種類較多，目前已確認(rèn)的水蛭有近700種，其中約100種是海洋物種，90種是陸生物種，其余的是淡水類群[9]。寬體金線蛭（Whitmania pigra）為淡水水蛭，屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物，有前后兩個(gè)吸盤，用于移動(dòng)和取食。該物種分布廣泛，具有較高的藥用價(jià)值，是水蛭養(yǎng)殖中的常見種類之一[10-11]。盡管水蛭與人類有密切關(guān)系，但對寬體金線蛭的腸道菌群研究相對較少?；诖耍狙芯渴褂酶咄繙y序技術(shù)測定了該物種腸道和土壤環(huán)境中的細(xì)菌群落，分析兩者間的菌群群落多樣性和結(jié)構(gòu)的差異，為了解寬體金線蛭的腸道細(xì)菌群落及與土壤環(huán)境間的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

在黃河三角洲地區(qū)進(jìn)行樣品采集。在寬體金線蛭養(yǎng)殖區(qū)域設(shè)置4塊1 m×1 m的樣地，清除可見的植物凋落物和石塊，從每塊樣地采集0～10 cm的表層土壤樣品，保存于干冰中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。從土壤中取出寬體金線蛭，放入原始棲息地的土壤中，然后活體帶回實(shí)驗(yàn)室。隨機(jī)抽取體重（2.0±0.6）g的寬體金線蛭，放入冰塊中，用75%乙醇和無菌蒸餾水清洗。然后在無菌條件下解剖金線蛭標(biāo)本，收集腸道組織。將采集的腸道組織（GUT）和土壤樣品（WS）保存在-80 ℃冰箱中，用于DNA提取。

1.2 高通量測序

使用土壤DNA試劑盒提取土壤樣本的總基因組DNA，并使用糞便DNA試劑盒提取水蛭腸道樣本的總基因組DNA。使用通用引物341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGGTATCTAATCC-3’）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)，擴(kuò)增條件為98 ℃變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min[12]。反應(yīng)混合物包括25 ng模板DNA、12.5 μL預(yù)混料、上、下游引物序列各2.5 μL和PCR級水。用2%瓊脂糖凝膠電泳法鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，用AMPure XT純化，用Qubit定量。在此基礎(chǔ)上，建立擴(kuò)增子庫，利用NovaSeq 6000測序儀進(jìn)行雙端2×250 bp測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測序過程、統(tǒng)計(jì)分析和雙端讀數(shù)組裝成基于條碼的樣本，切割條碼和引物序列。使用FLASH v1.2.8軟件合并對端讀數(shù)。通過篩選嵌合體和去除長度小于100 bp的序列，獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。使用QIIME2軟件中的除性擴(kuò)增去噪算法（DADA2）插件進(jìn)行復(fù)制，得到擴(kuò)增序列變異（ASV）表，并去除單態(tài)ASV，分析細(xì)菌多樣性組成[13]，使用Kruskal-Wallis計(jì)算細(xì)菌豐富度指數(shù)（Chao1指數(shù)）和多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)），評價(jià)細(xì)菌群落豐富度和多樣性。利用R語言繪制韋恩圖和主坐標(biāo)分析（Principal coordinates analysis，PCoA）圖。進(jìn)行置換多變量方差分析，對PCoA結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用Python LEfse包，進(jìn)行線性判別（LEfse）分析，分析組間差異，獲得不同分組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的微生物組成。采用PICRUST2對不同分組的菌群開展功能預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌菌群多樣性

本研究共獲得480 044個(gè)原始讀數(shù)。過濾原始讀數(shù)后，獲得479 411個(gè)有效讀數(shù)。由圖1可知，腸道組（GUT）和土壤組（WS）中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性存在差異。腸道細(xì)菌群落Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)明顯低于土壤組，說明相比于水蛭腸道菌群，土壤細(xì)菌群落更加多樣化。

韋恩圖（圖2）顯示了土壤和腸道菌群之間共享和獨(dú)有的ASV數(shù)量。GUT和WS組的ASV數(shù)分別為987和5 026個(gè)，共有的ASV數(shù)量為62個(gè)。共享ASV在兩組ASV總數(shù)中所占比例很小。表明土壤微生物中包含更多的ASV，具有更高的特異性。

基于未加權(quán)UniFrac距離的PCoA確定組間的組成結(jié)構(gòu)上的差異。由圖3可知，PC1和PC2分別解釋了31.26%和17.88%的變異（圖3）。PCoA結(jié)果顯示兩組細(xì)菌有明顯的分離，代表了細(xì)菌群落具有明顯的差異。此外，GUT組樣品間距離較小，表明水蛭腸道組的樣品比土壤組的樣品具有更高的相似性。

2.2 細(xì)菌菌群組成

細(xì)菌群落在門水平的相對豐度如圖4所示，水蛭腸道類群中相對豐度大于1%的類群為厚壁菌門（Firmicutes）40.64%、變形桿菌（Proteobacteria）28.94%、擬桿菌門（Bacteroidota）16.20%和梭桿菌門（Fusobacteriota）11.57%。土壤類群中相對豐度大于1%的類群為變形桿菌48.95%、擬桿菌門16.69%、放線菌門（Actinobacteriota）14.85%、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）12.87%和厚壁菌門1.52%。變形桿菌是兩組菌群中最豐富的類群。

由圖5可知，在屬水平上，除未分類屬外，腸道類群中優(yōu)勢屬（相對豐度gt;1%）為氣單胞菌屬（Aeromonas）23.76%、鯨桿菌屬（Cetobacterium）9.98%和刺骨魚屬（Epulopiscium）8.16%。土壤類群中優(yōu)勢屬為氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga）6.16%、黃桿菌屬（Flavobacterium）11.36%和氣單胞菌屬5.26%。兩者的細(xì)菌菌落屬水平的優(yōu)勢菌屬有所不同。

2.3 線性判別

LEfse分析可篩選不同分組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物學(xué)標(biāo)記，檢測具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的特征值，并將其定位到相應(yīng)的類群。由圖6可知，在門水平，放線菌門、藍(lán)藻菌門等在土壤組中具有重要功能，梭桿菌門、厚壁菌門在水蛭腸道菌群具有重要功能；在屬水平，黃桿菌屬、氫噬胞菌屬和紅細(xì)菌屬（Rhodobacter）等在土壤分組中具有重要功能，理研菌屬（Rikenella）和氣單胞菌屬等在水蛭腸道菌群具有重要功能。

2.4 功能預(yù)測

為探究不同分組的功能差異，將篩選獲得差異類群，通過原核生物同源蛋白庫數(shù)據(jù)集開展定位分析。由圖7可知，轉(zhuǎn)錄（Transcription）、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)（Chromatin structure and dynamics）、次生代謝物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解功能（secondary metabolites biosynthesis，transport and catabolism）等存在明顯功能差異。主要參與細(xì)菌體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)通路、碳循環(huán)通路和免疫等過程。

3 結(jié)論與討論

腸道微生物對宿主的健康和代謝具有重要作用。測序技術(shù)的發(fā)展有利于促進(jìn)對微生物群落的全面了解。腸道微生物的變化是由宿主特性（宿主的飲食、年齡和行為）和外部環(huán)境因素引起的。本研究對寬體金線蛭腸道細(xì)菌群落進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)其腸道細(xì)菌群落與土壤中的細(xì)菌群落有較小的相似性。土壤中的細(xì)菌多樣性和豐富度明顯較高。厚壁菌門、變形桿菌和擬桿菌門是腸道細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌門，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在一些甲殼類動(dòng)物的腸道中，優(yōu)勢細(xì)菌門為厚壁菌門，如黑虎蝦[14]、中華絨螯蟹[15]和南美白對蝦[16]，本研究結(jié)果與此具有相似性。變形桿菌具有兼性厭氧或必需厭氧的特點(diǎn)，能夠適應(yīng)一系列的好氧條件，具有更強(qiáng)的營養(yǎng)獲取能力[17]，因此是腸道優(yōu)勢菌群之一，有助于維持腸道厭氧環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡。在所有的腸道樣本中均未鑒定出類桿菌門的菌種，或者比例較低?？赡苁怯捎谄渌c道微生物的生物聚合物具有降解功能。

綜上，本研究使用高通量測序技術(shù)測定了金線蛭腸道和土壤中的細(xì)菌群落。結(jié)果表明，該物種腸道和土壤樣品中的細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)存在明顯差異，兩者間的優(yōu)勢菌門和菌屬存在差異，細(xì)菌群落的相似性較小，且在轉(zhuǎn)運(yùn)通路、碳循環(huán)通路和免疫等方面存在差異。表明土壤對腸道細(xì)菌群落的建立影響不大。關(guān)于土壤和寬體金線蛭腸道細(xì)菌群落差異的原因還有待進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

[1] LEE W J，HASE K. Gut microbiota-generated metabolites in animal health and disease[J]. Nature chemical biology，2014，10：416-424.

[2] XUE J J，AJUWON K M，F(xiàn)ANG R J. Mechanistic insight into the gut microbiome and its interaction with host immunity and inflammation[J]. Animal nutrition，2020，6（4）：421-428.

[3] XIONG J B，WANG K，WU J F，et al. Changes in intestinal bacterial communities are closely associated with shrimp disease severity[J]. Applied microbiology and biotechnology，2015，99（16）：6911-6919.

[4] GONG L X，LIU B Y，WU H，et al. Seasonal dietary shifts alter the gut microbiota of avivorous bats：implication for adaptation to energy harvest and nutritional utilization[J]. mSphere，2021，6（4）：e0046721.

[5] ZHANG Q，ZHANG Z Y，LU T，et al. Gammaproteobacteria，a core taxon in the guts of soil fauna，are potential responders to environmental concentrations of soil pollutants[J]. Microbiome，2021，9（1）：196.

[6] 劉月姣，李儉杰，孫一凡，等. 利用培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)分離培養(yǎng)肺部微生物群研究[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2022，62（3）：1110-1118.

[7] 嚴(yán)瓊英，林霖，葉秀玲，等. 應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳和16S rDNA技術(shù)分析果凍脹氣原因[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2015，6（12）：5041-5045.

[8] 劉驍蒨，尤凡，尹航，等. 變性梯度凝膠電泳技術(shù)在馬屬動(dòng)物腸道微生物多樣性研究中的應(yīng)用[J]. 科技與創(chuàng)新，2020（10）：156-157，159.

[9] TONG L，DAI S X，KONG D J，et al. The genome of medicinal leech （Whitmania pigra） and comparative genomic study for exploration of bioactive ingredients[J]. BMC genomics，2022，23（1）：76.

[10] 鄭利，覃川杰. 寬體金線蛭研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（20）：1-5，8.

[11] 何昶昊，陳曉瑩，張曉萌，等. 寬體金線蛭作為藥用水蛭基原的考證[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2021，18（24）：112-115.

[12] LOGUE J B，STEDMON C A，KELLERMAN A M，et al. Experimental insights into the importance of aquatic bacterial community composition to the degradation of dissolved organic matter[J]. ISME journal，2016，10（3）：533-545.

[13] CALLAHAN B J，MCMURDIE P J，ROSEN M J，et al. DADA2：High-resolution sample inference from Illumina amplicon data[J]. Nature methods，2016，13：581-583.

[14] RUNGRASSAMEE W，KLANCHUI A，CHAIYAPECHARA S，et al. Bacterial population in intestines of the black tiger shrimp （Penaeus monodon） under different growth stages[J]. PLoS one，2013，8（4）：e60802.

[15] LI K，GUAN W，WEI G，et al. Phylogenetic analysis of intestinal bacteria in the Chinese mitten crab （Eriocheir sinensis）[J]. Journal of applied microbiology，2007，103（3）：675-682.

[16] 孫振麗，宣引明，張皓，等. 南美白對蝦養(yǎng)殖環(huán)境及其腸道細(xì)菌多樣性分析[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2016，23（3）：594-605.

[17] WANG N，WANG W H，JIANG Y J，et al. Variations in bacterial taxonomic profiles and potential functions in response to the gut transit of earthworms （Eisenia fetida） feeding on cow manure[J]. Science of the total environment，2021，787：147392.

（責(zé)任編輯：胡立萍）