摘 要：【目的】摸清國內(nèi)圓葉桉Eucalyptus pulverulenta花卉資源遺傳多樣性概況，為種質資源利用及分子育種提供參考。【方法】利用多態(tài)性高的15個SSR標記，對7個來源的59株圓葉桉進行SSR基因分型和遺傳多樣性分析?！窘Y果】1）59株圓葉桉在15個SSR標記共檢測到83個等位片段數(shù)（NA），平均每個標記的等位片段數(shù)為5.5個，每個標記的等位片段數(shù)2～10個，平均有效等位片段數(shù)（NE）2.4個。觀測雜合度（HO）和期望雜合度（HE）的平均值為0.401和0.491，多態(tài)性信息量（PIC）的平均值為0.455，具有較高的多態(tài)性。圓葉桉群體間遺傳分化系數(shù)（Fst）為0.208，即有20.8%的變異存在于不同群體間；2）個體間遺傳距離范圍為0.033～0.698，平均為0.377，群體間親緣關系較近，遺傳背景相對單一。圓葉桉群體分為兩個亞組，與其天然分布范圍一致；3）圓葉桉群體間的遺傳一致度為0.533～0.987，來自云南佳藝園藝和云南綠夢花卉的圓葉桉遺傳一致度最高，推測二者可能為來源相同的品種。分子方差分析（AMOVA）結果表明個體間變異是方差分量的主要來源?！窘Y論】15個SSR標記遺傳多態(tài)性較高，可用于圓葉桉的遺傳分化研究。個體間的分型結果表明，國內(nèi)市場上常見的圓葉桉均為有性繁殖的實生苗，不同來源圓葉桉群體間的遺傳分化程度較小，遺傳變異主要發(fā)生在個體間。本研究對圓葉桉進行遺傳多樣性和遺傳結構分析，對種質資源的評價和利用都具有重要意義。

關鍵詞：圓葉桉；SSR標記；遺傳多樣性；遺傳關系

中圖分類號：S792.39 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）10-0157-08

基金項目：“十四五”國家重點研發(fā)計劃項目（2022YFD2200203-2）；廣州市基礎研究計劃基礎與應用基礎研究項目（202102080550）；廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目（2023KJCX013）。

Genetic analysis of Eucalyptus pulverulenta based on SSR markers

ZHAO Jingyi1，2， QI Xiaohui3， QU Guanzheng1， WU Youjun2， LI Zhuo2， ZHOU Changpin1，2

Abstract：【Objective】In order to find out genetic diversity condition of Eucalyptus pulverulenta resources in China， and to provide reference for germplasm resources utilization and molecular breeding.【Method】15 SSR makers with high polymorphism were used for genotyping and genetic diversity analysis of 59 E. pulverulenta from 7 sources.【Result】1） A total of 83 alleles were detected by 15 SSR markers， averaging 5.5 alleles per marker， the number of alleles per marker ranged from 2 to 10， averaging 2.4 effective alleles per marker. The average value of observed heterozygosity and expected heterozygosity were 0.401 and 0.491， respectively. The general polymorphism was high with an average polymorphic information content of 0.455， indicating these markers were suitability for studying genetic differentiation of E. pulverulenta. The genetic differentiation coefficient between populations （Fst） was 0.208， it indicated that there occurred 20.8% genetic variation among populations； 2） The genetic distance varied from 0.033 to 0.698， with an average of 0.377. The results indicated that the genetic background was relatively single and the genetic relationship was close. The cluster analysis showed that 59 samples were clustered into two subgroups， which was consistent with the natural distribution of E. pulverulenta； 3） The genetic coefficient of the populations ranged from 0.533 to 0.987. The genetic coefficient of E. pulverulenta from Yunnan Jiayi Horticulture and Yunnan Lümeng Huahui was the highest， which suggested that the two populations might be from the same source. Analysis of molecular variance showed that individual variation is the main source of variance component.【Conclusion】This study used 15 SSR markers， which had high genetic polymorphisms and could be used to study the genetic differentiation of E. pulverulenta. The results of cluster analysis among individuals showed that the common E. pulverulenta in the domestic market are generative reproduced seedlings. The extent of genetic differentiation among different populations were at a low level， and most of variations existed within individuals. The results will be great significance for the germplasm resource evaluation and utilization in E. pulverulenta.

Keywords： Eucalyptus pulverulenta； SSR marker； genetic diversity； genetic relationship

圓葉桉Eucalyptus pulverulenta又名銀葉山桉，是桃金娘科Myrtaceae桉屬Eucalyptus L’Hérit.藍桉組Section Maidenaria樹種，多為灌木或小喬木，幼態(tài)葉對生，圓形或心形無柄，被藍灰色臘粉，幼莖呈藍灰色，其自然分布于澳大利亞新南威爾士州和塔斯馬尼亞州，屬地中海氣候區(qū)[1]。圓葉桉多為種子繁殖，大量的宿芽使其具有強大的萌蘗能力，枝條多用于鮮切花插花和花藝等，具有極高的園藝觀賞價值和商業(yè)價值[2]。研究人員對引種的26種芳香植物種的觀賞性狀（株型、葉片）、生態(tài)適應性（抗性、花期）以及擴繁價值等進行綜合評價，圓葉桉被評為“極優(yōu)”[3]。圓葉桉在美國、意大利和日本等國家被廣泛引種，近年來相繼推出‘藍寶貝’、‘銅錢桉’、‘冰點’和‘藍夢’等品種[4]。當前在云南昆明、曲靖等地區(qū)大面積栽培，在浙江和福建等省份亦有少量種植，表現(xiàn)出一定的適應性，但在我國華南地區(qū)難以過夏，種植情況普遍不佳。

簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）是一組以1～6個核苷酸為重復單位串聯(lián)成的重復序列，具有共顯性、多態(tài)性高、標記數(shù)量多、覆蓋范圍廣等優(yōu)點[5]。SSR不僅在巨桉E.grandis、尾葉桉E.urophylla、細葉桉E.tereticornis、赤桉E.camaldulensis、檸檬桉E.citriodora、粗皮桉E.pellida和大花序桉E.cloeziana等桉樹的連鎖圖譜構建、種質資源鑒定[6-7]、遺傳多樣性分析[8-9]、群體結構分析[10-11]、數(shù)量性狀位點定位[12]和關聯(lián)分析[13]等研究中廣泛應用，而且也多用于花卉等的品種鑒定[14]。目前，對于圓葉桉的研究仍較少，且多集中在引種、苗木繁育、生理生化等方面[15]，關于遺傳多樣性、群體遺傳結構分析等分子水平的研究尚未有報道。

圓葉桉觀賞價值高，市場潛力巨大。當前，國內(nèi)種植的圓葉桉花卉遺傳基礎不明確，具有自主知識產(chǎn)權的新品種缺乏等問題突出，制約了圓葉桉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本研究利用多態(tài)性高的15個SSR標記[16-17]，對國內(nèi)市場銷售及不同來源的 59株圓葉桉進行遺傳多樣性分析，以推動圓葉桉種質資源的評價和利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及DNA提取

參試材料為國內(nèi)在售和來自澳大利亞林木種子中心種子繁育的圓葉桉花卉，7個來源共59株（表1）。采集葉片后-80 ℃下保存，DNA提取采用改良CTAB法[18]，使用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，美國）對DNA的濃度和純度進行檢測。

1.2 SSR分型與多態(tài)性檢測

利用桉樹中已開發(fā)的15個多態(tài)性高的SSR標記[16-17]，對59株圓葉桉樣品進行PCR擴增和多態(tài)性檢測。引物由上海生工公司合成，前向引物5′端采用FAM、HEX、TAM或ROX進行熒光修飾。PCR采用10 μL體系，包括：10×Buffer 1 μL、25 μmol/L dNTPs、0.5 μmol/L前向引物和后向引物、0.1 U Taq聚合酶（申能博彩生物科技有限公司）及5 ng DNA模版，ddH2O補齊至10 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min；35個循環(huán)：94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s；最終72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取1 μLPCR產(chǎn)物、9.34 μL超純甲酰胺（Applied Biosystems，美國）、0.16 μL GeneScan 500-LIZ內(nèi)標（Applied Biosystems，美國）混勻，95 ℃變性5 min，迅速冰浴冷卻，利用ABI 3130XL測序儀（Applied Biosystems，美國）進行SSR標記分型，按照儀器說明進行上機操作。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用GeneMapper 4.0軟件統(tǒng)計樣品的熒光檢測結果；使用PowerMarker 3.25軟件[19]計算等位片段數(shù)（NA）、有效等位片段數(shù)（NE）、多態(tài)性信息含量（PIC）和Nei’s遺傳距離；使用GenAlEx 6.5.1軟件[20]計算等位片段范圍（ASR）、觀測雜合度（HO）、期望雜合度（HE）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）、主要等位基因頻率（MAF）、遺傳分化系數(shù)（Fst），進行分子方差分析（AMOVA）；使用NTSYSpc2.1軟件進行聚類分析并構建遺傳聚類圖。

2 結果與分析

2.1 SSR標記的遺傳多樣性檢測

本研究提取的59株圓葉桉DNA的OD260/OD280在1.80～2.00之間，符合后續(xù)試驗要求。利用15個SSR熒光標記（表2）對59株圓葉桉進行了PCR擴增，并利用毛細管電泳法進行分型檢測，分型結果帶型清晰，易于片段統(tǒng)計。圖1為多態(tài)性高的2個SSR（EUCeSSR204和EUCeSSR1128）標記對5個待測樣品（A01、HNQS1、HNYXFF3、SHDSL1、YN01）的分型結果。15個SSR標記共檢測到83個等位片段（Number of Alleles，NA），平均每個標記的等位片段數(shù)為5.5個，EUCeSSR176和EUCeSSR1044擴增出的NA最多，為10個，EUCeSSR263擴增出的NA最少，僅2個。平均每個標記的有效等位片段數(shù)（Effective number of alleles，NE）為2.4個，等位片段范圍（Allele size range，ASR）為128～464 bp。觀測雜合度（Observed heterozygosity，Ho）的變化范圍為0.034（EUCeSSR263）～0.695（EUCeSSR204），平均值為0.401。期望雜合度（Expected Heterozygosity，HE）的變化范圍為0.033～0.801（標記同HO），平均值為0.491，為中等水平。15個標記的多態(tài)性信息含量（Polymorphic Information Content，PIC）存在差異，變化范圍為0.033～0.776，平均值為0.455，按PIC≥0.5為高多態(tài)性標記，0.25≤PIC<0.5為中度多態(tài)性標記，PIC<0.25為低多態(tài)性標記的標準[21]，15個標記中有7個高多態(tài)性標記、5個中度多態(tài)性標記和3個低多態(tài)性標記。主要等位片段頻率（Major allele frequency，MAF）的變化范圍為0.331～0.983，平均值為0.644（表2）。不同SSR標記的遺傳分化系數(shù)（Fst）差異較明顯，變化范圍為0.061（EUCeSSR1044）～0.508（EUCeSSR475），平均值為0.208，即有20.8%的變異存在于不同群體間，近79%的變異存在于圓葉桉個體間，說明各群體間的遺傳分化程度較低。

2.2 圓葉桉個體間遺傳關系聚類分析

基于15個SSR標記分型檢測數(shù)據(jù)計算59株圓葉桉的遺傳距離，采用不加權算術平均組對方法（Unweighted pair-group method using arithmetic average，UPGMA）進行聚類分析，構建遺傳聚類圖（圖2）。59株圓葉桉樣品的遺傳距離的范圍為0.033（YN02和YN11）～0.698（A10和HNQS3），平均為0.377，表明不同來源的圓葉桉之間存在著一定差異。利用15個SSR標記可對59株圓葉桉進行有效的鑒定，表明當前國內(nèi)圓葉桉花卉均采用種子種植的方式進行繁育。

聚類分析結果表明，在遺傳距離為0.56時，59株圓葉桉可分為2個亞組，來自澳大利亞林木種子中心、云南佳藝園藝、云南綠夢花卉、湖南丘山園藝、上海大森林園藝、湖南衣想菲菲的全部圓葉桉和來自福建宏優(yōu)家居的SHH1被分在第一亞組，來自福建宏優(yōu)家居的4株圓葉桉（SHH2、SHH3、SHH4、SHH5）被分在第二亞組。這與圓葉桉天然分布于澳大利亞東南部的新南威爾士州和塔斯馬尼亞州的溫帶地區(qū)2個種源的分類結果一致[1]。59株圓葉桉品種具有一定的遺傳多樣性，可劃分為2個群體，但親緣關系較近，遺傳背景相對單一。

2.3 圓葉桉群體間遺傳多樣性檢測

對7個不同來源的圓葉桉群體進行遺傳多樣性檢測（表3），NA、NE、I、HO、HE參數(shù)均有差異，但相差均不大，HO與HE差距很小。其中來自云南佳藝園藝的圓葉桉NE、I、HE參數(shù)值最高，分別為2.4、0.890、0.506，遺傳多樣性豐富；來自澳大利亞林木種子中心的圓葉桉NA最高，為3.3；來自湖南丘山園藝的圓葉桉HO最高，為0.560。來自湖南衣想菲菲的圓葉桉參數(shù)值均為最低，說明該圓葉桉群體遺傳多樣性較低。

利用15個SSR標記，對7個不同來源的圓葉桉群體進行遺傳多樣性分析（表4），7個群體的遺傳一致度為0.533～0.987，遺傳一致度最小（0.533）的兩個群體為來自福建宏優(yōu)家居（R5）和云南佳藝園藝（R6）的圓葉桉；遺傳一致度最大（0.987）的為來自云南佳藝園藝（R6）和云南綠夢花卉（R7）的圓葉桉，結合聚類分析結果（圖3），推測R6和R7圓葉桉為來源相同的圓葉桉品種。7個群體間的遺傳距離為0.013～0.628，平均遺傳距離為0.262，表明不同來源的圓葉桉群體間遺傳差異較小。

根據(jù)7個群體間的遺傳相似性按照UPAMA方法進行聚類分析，構建遺傳聚類圖（圖3）。當遺傳相似性系數(shù)為0.74時，7個群體被分為兩大類群，第一類群為來自澳大利亞林木種子中心（R1）、湖南丘山園藝（R2）、湖南衣想菲菲（R3）、上海大森林（R4）、云南佳藝園藝（R6）、云南綠夢花卉（R7）的圓葉桉；第二類群為來自福建宏優(yōu)家居（R5）的圓葉桉，該結果與圓葉桉個體間聚類分析的結果一致。分子方差分析（Analysis of molecular variances，AMOVA）結果（表5）表明群體間變異占總方差分量的19%，與Fst遺傳分化結果（20.8%）基本一致。個體間變異是方差分量的主要來源，占78%，群體內(nèi)個體間變異最少，占總方差分量的3%。

3 結論與討論

3.1 討 論

遺傳多樣性一般是物種內(nèi)部、群體間或種群內(nèi)部個體間遺傳變異的總和，林木遺傳多樣性的研究可以用于輔助改良品種、保存種質資源以及解釋不同群體間的相關性等，是林木遺傳改良的基礎[22]。遺傳多樣性分析可通過形態(tài)學標記[23]和分子標記[24]等手段，從不同角度研究和分析林木的遺傳變異，然而可直接用于鑒別的形態(tài)學標記數(shù)量有限，且多數(shù)形態(tài)學標記還受到環(huán)境和基因互作等影響，判別過程較為困難。隨著分子標記技術的發(fā)展，SSR技術成為研究植物遺傳多樣性分析、品種鑒定、親緣關系分析的重要工具。經(jīng)篩選，本研究所用的SSR標記條帶干凈、整齊，便于分型，可用于遺傳多樣性分析，相關標記可用于今后圓葉桉品種和無性系的鑒定。所選標記在圓葉桉中均能較好地擴增，且表現(xiàn)出較高的多態(tài)性（中、高多態(tài)性標記占總標記的80%），表明SSR標記在不同桉樹樹種中呈現(xiàn)較高的通用性，可被較好地應用于種間遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定等相關研究。

利用分子標記開展圓葉桉群體遺傳多樣性分析的研究尚未見研究報道。本研究中的15個SSR標記，9個在巨桉中的PIC均值為0.529，HO均值為0.403[16]；6個在尾葉桉和細葉桉中的PIC均值為0.657，HO均值為0.451[17]，均為高多態(tài)性標記。圓葉桉中的PIC均值為0.455，HO均值為0.401，HE均值為0.491，這與上述2個樹種的多樣性水平類似，但PIC均值略低，說明相同的標記在不同的樹種中的遺傳多樣性存在差異。前人利用等位酶分析法在4個圓葉桉群體中開展了遺傳多樣性分析研究，但多態(tài)性較低，其中PIC均值為0.27，HE為0.07，HO為0.05[25]，說明不同的研究方法對群體多態(tài)性水平檢測結果存在差異，當然這也與參試材料的來源和數(shù)量有關?；赟SR標記的圓葉桉遺傳多樣性水平普遍小于粗皮桉（PIC=0.718，HO=0.515，HE=0.722）[8]、大花序桉（PIC=0.771，HO=0.670，HE=0.804）[9]和巨桉（PIC=0.755，HO=0.631，HE=0.777）[13]等桉樹，這可能與圓葉桉自然分布窄以及觀賞性圓葉桉的人為選擇有關。本研究中，7個不同來源的圓葉桉群體遺傳多樣性參數(shù)存在差異，其中云南佳藝園藝圓葉桉群體的NE、I、HE參數(shù)值最高，NA和HO參數(shù)值高于平均值，該群體遺傳多樣性較為豐富；湖南衣想菲菲圓葉桉群體的遺傳多樣性較低，NA、NE、HO、HE和I等參數(shù)值最低。相關研究認為，更多的標記能使品種間鑒定結果更加準確可靠，選擇較多的個體數(shù)量更能有效反映群體多樣性的水平[10]。本研究雖選擇了遺傳多樣性高的SSR標記對來自澳大利亞林木種子中心種子繁育和國內(nèi)在售的圓葉桉花卉進行基因分型，但并未進行大規(guī)模的標記篩選。在今后的研究中，可適當增加或選擇雜合度更高的SSR標記，對不同種源/家系的圓葉桉開展遺傳多樣性的系統(tǒng)分析。

圓葉桉天然分布于澳大利亞東南部的新南威爾士州和塔斯馬尼亞州[1]，兩州之間間隔巴斯海峽，存在一定程度的地理隔離，但地理位置上相距較近。本研究中的7個圓葉桉群體可分為2個亞組，其遺傳背景相對單一，群體分化水平較低，這與圓葉桉2個種源的天然分布情況一致。AMOVA分析結果表明，圓葉桉群體間變異占總方差分量的19%，高于大花序桉的3%[10]、細葉桉的1.2%，個體間變異占總方差分量的81%。圓葉桉群體間變異水平雖高于其他桉樹樹種，但主要的遺傳變異仍來源于個體間，這表明7個不同來源圓葉桉的分布范圍和氣候類型并未引起明顯的遺傳分化。在今后圓葉桉優(yōu)良性狀的遺傳改良研究中，可以充分利用個體間的遺傳變異。當前，國內(nèi)市場主要種植‘藍寶貝’和‘銀水滴’等品種，隨著圓葉桉市場規(guī)模的擴大，栽培中種植混亂、苗期優(yōu)良品種表型難以分辨，利用本研究選用的SSR分子標記，亦可用于圓葉桉品種的鑒定工作。商品化圓葉桉群體聚類分析結果證實了國內(nèi)圓葉桉種苗均為有性繁育，種子繁育的實生苗在葉形、葉色等方面存在遺傳分化，一定程度上影響了花枝材的質量等級。當前國內(nèi)仍缺乏具有自主知識產(chǎn)權的圓葉桉花卉新品種（http：//cnpvp.flashfox. tech/），在今后的研究和生產(chǎn)中應加強優(yōu)良品種選育，通過大范圍的引種試驗探索適應夏雨型氣候區(qū)的種植模式，挖掘適生范圍更廣的新種質，以擴大圓葉桉在我國的種植范圍；積極摸索圓葉桉的組培、扦插等無性擴繁方法，以期獲得表現(xiàn)優(yōu)良、性狀穩(wěn)定、適生范圍廣泛的圓葉桉花枝材。

3.2 結 論

本研究利用SSR分子標記技術對59株圓葉桉種質資源進行遺傳多樣性分析和聚類分析，所用的15個SSR標記在圓葉桉中均能穩(wěn)定擴增，PIC均值為0.455，遺傳多態(tài)性較高，可用于圓葉桉的遺傳分化研究。圓葉桉個體間基因分型結果表明，國內(nèi)市場上常見的圓葉桉均為有性繁殖的實生苗，聚類分析將其分為2個亞組，與圓葉桉天然分布情況一致。圓葉桉群體間的遺傳分化程度較小，81%的遺傳變異存在于個體間，為遺傳變異的主要來源。本研究為圓葉桉種質資源保護和評價、親緣關系分析、品種分子鑒定等提供了理論基礎。

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[本文編校：吳 彬]