摘" " 要：為探究谷子糖基轉(zhuǎn)移酶基因的生物學(xué)功能及調(diào)控作用，以谷子為材料，利用RT-PCR技術(shù)從谷子農(nóng)家品種毛毛亮擴(kuò)增獲得1 338 bp包含完整編碼區(qū)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因（SiDDOST）cDNA序列，并通過(guò)生物信息學(xué)方法分析SiDDOST全長(zhǎng)序列的特征，利用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和PmlⅠ，分別將目的基因片段與植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA3301雙酶切，然后切膠回收基因片段和載體片段，通過(guò)T4 DNA連接酶將糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段與過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA3301連接，重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)重組表達(dá)載體與空載體電泳檢測(cè)、菌液PCR、雙酶切分析驗(yàn)證。結(jié)果表明：谷子糖基轉(zhuǎn)移酶基因CDS區(qū)為1 323 bp，編碼441個(gè)氨基酸，DDOST蛋白N末端的30個(gè)氨基酸范圍保守性差，糜子與其他8種植物相比，DDOST蛋白存在3處插入/缺失突變；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，谷子與糜子、哈希黍、柳枝稷存在較近進(jìn)化關(guān)系；目的基因片段已成功插入表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)錄方向正確。綜上，本研究構(gòu)建的谷子糖基轉(zhuǎn)移酶基因過(guò)表達(dá)載體為后續(xù)在擬南芥、水稻或谷子中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化、功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：谷子；糖基轉(zhuǎn)移酶基因；克??；生物信息學(xué)分析；載體構(gòu)建

中圖分類號(hào)：S515" " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.10.001

Cloning of Glycosyltransferase Gene SiDDOST and Construction of Expression Vector in Foxtail Millet

LI Xingjie， WANG Zhenshan， LUAN Mengao， JIA Xiaoping

（College of Agriculture， Henan University of Science and Technology， Luoyang， Henan 471023， China）

Abstract： In order to explore the biological function and regulatory role of glycosyltransferase gene in foxtail foxtail foxtail fox Mao Maoliang amplified the 1 338 bp cDNA sequence of the glycosyltransferase gene （SiDDOST） containing the complete coding region， and analyzed the characteristics of the full-length sequence of SiDDOST by bioinformatics methods， and the target gene fragment was double-digested with the restriction enzyme Nco I and Pml I， respectively， and the gene fragment and the vector fragment were recovered， and the glycosyltransferase gene fragment was linked to the overexpression vector pCAMBIA3301 by T4DNA ligase， and the recombinant expression vector was transformed into E. coli DH5α. It was verified by electrophoresis detection of recombinant expression vector and empty vector， PCR of bacterial solution， and double enzyme digestion analysis. The results showed that the CDS region of glycosyltransferase gene was 1 323 bp and encoded 441 amino acids， the range of 30 amino acids at the N-terminus of DDOST protein was poorly conserved， and there were three insertion/deletion mutations in DDOST protein compared with 8 other plant species. This indicated that the gene fragment of interest had been successfully inserted into the expression vector and the transcription direction was correct. In conclusion， the overexpression vector of foxtail millet glycosyltransferase gene constructed in this study lays a foundation for subsequent genetic transformation and functional verification in Arabidopsis thaliana， rice or foxtail millet.

Key words： foxtail millet; glycosyltransferase gene; cloning; bioinformatics analysis; vector construction

糖基轉(zhuǎn)移酶基因是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的生物分子，它的功能是將活性糖基從核苷糖轉(zhuǎn)移到激素、次級(jí)代謝產(chǎn)物、病原菌感染物和植物內(nèi)外源毒性物質(zhì)中。糖基轉(zhuǎn)移酶的分類標(biāo)準(zhǔn)可以按照糖基化位點(diǎn)、作用底物的結(jié)構(gòu)特異性、催化機(jī)制分為3種[1-2]。由于作用底物和產(chǎn)物都具有立體異構(gòu)性，本研究將糖基轉(zhuǎn)移酶的作用機(jī)理分成2類，包括構(gòu)型保持型和構(gòu)型翻轉(zhuǎn)型[3-4]。植物中糖基轉(zhuǎn)移酶的生理作用主要有以下幾個(gè)方面：（1）植物糖基轉(zhuǎn)移酶能夠穩(wěn)定調(diào)節(jié)激素，使之達(dá)到平衡[5]。（2）植物糖基轉(zhuǎn)移酶能夠調(diào)節(jié)植物的次級(jí)新陳代謝反應(yīng)[6-7]。（3）植物可以利用糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行脫毒處理，從而提高其品質(zhì)，也能夠?qū)ν饨绛h(huán)境中的毒素進(jìn)行處理，從而對(duì)植株的品質(zhì)、產(chǎn)量產(chǎn)生一定影響[8]。（4）植物糖基轉(zhuǎn)移酶能夠參與植物的防御反應(yīng)[9]。（5）植物糖基轉(zhuǎn)移酶能夠參與植物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Knauer等[10]研究發(fā)現(xiàn)，DDOST編碼1個(gè)48 kDa寡糖轉(zhuǎn)移酶（OST）復(fù)合體亞基，催化N-糖基化（將N-連接的聚糖前體轉(zhuǎn)移到候選蛋白的Asn殘基上）。在擬南芥中，DGL1是DDOST的直系同源基因，影響非纖維素細(xì)胞壁多糖的組成，該基因嚴(yán)重突變會(huì)導(dǎo)致胚胎致死[11]。水稻同源基因OsDGL1參與根系發(fā)育[12]。除了擬南芥和水稻，目前有關(guān)其他作物DDOST基因功能的研究尚未報(bào)道，因此有必要進(jìn)一步揭示該基因在調(diào)控作物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)制。

谷子（Setaria italica）起源于中國(guó)，距今8 000年前后在黃河流域被馴化，在日本、印度等亞洲東部，非洲和美洲北部等地都有栽培[13-14]，它與甘蔗、高粱、玉米、糜子等作物有著較近的親緣關(guān)系[15-18]。谷子作為二倍體作物，具有耐貧瘠、耐干旱、高光效等特征，是很有發(fā)展前景的禾谷類作物[19]。穗分枝數(shù)是谷子產(chǎn)量的重要構(gòu)成性狀，揭示其形成分子機(jī)制對(duì)于利用分子輔助選育理想高產(chǎn)穗型谷子新品種具有重要意義。前期筆者從谷子穗分枝數(shù)關(guān)聯(lián)基因組區(qū)域發(fā)現(xiàn)1個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因，單倍型分析表明，該基因變異位點(diǎn)與穗分枝數(shù)相關(guān)。本研究首次從谷子中克隆糖基轉(zhuǎn)移酶基因，并構(gòu)建到植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA3301上，為后續(xù)轉(zhuǎn)化擬南芥和水稻進(jìn)行功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

谷子材料選用河南省農(nóng)家品種毛毛亮。 pCAMBIA3301植物表達(dá)載體由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供。

1.2 谷子材料的種植與樣品收集

將1個(gè)完全成熟的穗脫粒，種子種在裝有營(yíng)養(yǎng)土的塑料花盆內(nèi)（10 cm×10 cm），種植6盆，放置于GZX-150B型光照培養(yǎng)箱，并進(jìn)行長(zhǎng)日照培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度26 ℃，光周期為15 h光照/9 h黑暗。待長(zhǎng)至2葉期時(shí)，進(jìn)行間苗，每盆留2株。抽穗第5 天時(shí)，取葉片部位的樣品，剪取谷穗并放入液氮速凍。

1.3 SiDDOST基因的克隆與測(cè)序

1.3.1 谷子材料總RNA的提取與純化 RNA提取使用UL trapure RNA Kit試劑盒，該試劑盒由TRIzon Reagent和Gel Extraction Kit 2部分組成。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，儲(chǔ)存在-70 ℃冰箱中。RNA的純度和濃度用NanoDropTM One微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄 采用寶生物（TaKaRa）PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）試劑盒，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，RNA總量為1 000 ng，在冰上操作，于-70 ℃條件下保存。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 根據(jù)phtozome谷子數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.phytozome.net/search.php）中糖基轉(zhuǎn)移酶（登錄號(hào)：Seita.2G081100）序列信息進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列如下：

SiDD-F：5’-ATCCATGGATGGCGACGCCGCGG

CAC-3’

SiDD-R：5’-CGCACGTGCTATTTGTGGTACAG

GTACACA-3’

PCR反應(yīng)體系：Apex HFHS DNA Polymerase FS（1 U·μL-1）2.5 μL，5×ApexHF FS Buffer（Mg2+ plus）10 μL，稀釋10倍之后的cDNA模板2.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各2 μL，dNTP Mix（10 mMeach）1 μL，ddH2O補(bǔ)足到50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并按膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)方法凈化、回收目的產(chǎn)物。

1.3.4 序列測(cè)定 將基因擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑選陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序。

1.4 SiDDOST基因的生物信息學(xué)分析

1.4.1 序列比對(duì)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載谷子、哈希黍、高粱、柳枝稷、玉米、水稻、野生二粒小麥、大麥、糜子9種植物DDOST基因編碼氨基酸序列，利用Clustalw1.8軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，揭示DDOST蛋白的保守區(qū)域（表1）。

1.4.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析 基于9種植物DDOST蛋白氨基酸序列，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并分析這些植物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

1.4.3 SiDDOST基因的表達(dá)分析 從phytozome v13（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）下載豫谷1號(hào)DDOST基因表達(dá)數(shù)據(jù)，用Excel 16繪制柱狀圖，揭示SiDDOST基因的組織特異性表達(dá)規(guī)律。

1.5 SiDDOST基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

將pCAMBIA3301載體與目的基因同時(shí)用NcoⅠ和PmlⅠ進(jìn)行雙酶切，膠回收線性載體pCAMBIA3301和目的片段，利用Nanodrop測(cè)定回收片段的濃度，計(jì)算體積，設(shè)計(jì)10 μL連接反應(yīng)體系，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)過(guò)菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證目的基因是否成功插入載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子糖基轉(zhuǎn)移酶基因的擴(kuò)增及測(cè)序

以谷子毛毛亮總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板，用特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。電泳結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物約1 300 bp，與預(yù)期大小一致。測(cè)序后，獲得大小為1 338 bp的cDNA序列，CDS區(qū)長(zhǎng)度為1 326 bp，編碼441個(gè)氨基酸（圖2、圖3）。

2.2 SiDDOST基因的生物信息學(xué)分析

對(duì)谷子、哈希黍、高粱、柳枝稷、玉米、水稻、野生二粒小麥、大麥、糜子9種植物DDOST基因編碼氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，谷子與水稻、玉米、哈希黍、高粱、柳枝稷、玉米、水稻、野生二粒小麥、大麥7種植物DDOST基因氨基酸序列相似，與糜子基因氨基酸序列存在變異。在第60～140個(gè)氨基酸序列內(nèi)，糜子DDOST蛋白序列較谷子缺失了5個(gè)氨基酸；在第300～380個(gè)氨基酸序列內(nèi)，糜子DDOST蛋白序列較谷子插入了13個(gè)氨基酸；在蛋白質(zhì)末端，糜子比谷子缺失了12個(gè)氨基酸（圖4）。

基于9種植物DDOST蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，筆者發(fā)現(xiàn)，野生二粒小麥和大麥聚為1個(gè)分類群，而其余8種植物聚為1個(gè)大分類群。大分類群中，水稻單獨(dú)聚為1個(gè)亞群，其余7個(gè)C4植物聚為1個(gè)亞群。在C4植物聚類群中，谷子與糜子、哈希黍、柳枝稷的進(jìn)化關(guān)系要比玉米、高粱更近（圖5）。

2.3 SiDDOST基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

本研究對(duì)目的基因與pCABIA3301表達(dá)載體同時(shí)用NcoⅠ和PmlⅠ進(jìn)行雙酶切，膠回收后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。由圖6可知，條帶1為酶切后載體片段，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2 000 bp，符合載體預(yù)期大小，條帶2為目的基因酶切后片段，位置在1 300 bp附近。這與糖基轉(zhuǎn)移酶基因預(yù)期大小一致。

對(duì)構(gòu)建好的重組表達(dá)載體與空載體同時(shí)進(jìn)行電泳檢測(cè)。由圖7可知，條帶1為空載體，條帶2為重組表達(dá)載體，條帶1片段小于條帶2。這初步說(shuō)明目標(biāo)基因已經(jīng)成功連接到載體上。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證目的基因已插入載體，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增。由圖8可知，大約在1 300 bp的位置處有1個(gè)條帶，其大小與目的基因預(yù)期大小一致。這進(jìn)一步證明糖基轉(zhuǎn)移酶基因已經(jīng)插入載體中。

由圖9可知，對(duì)獲得的重組表達(dá)載體pCAMBIA3301目的片段用酶切的方法進(jìn)行鑒定，酶切產(chǎn)物電泳后在約1 300 bp處有1個(gè)條帶，與目標(biāo)條帶大小一致。這進(jìn)一步表明糖基轉(zhuǎn)移酶基因已整合到pCAMBIA3301載體上，植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

Phytozome 谷子數(shù)據(jù)庫(kù)基因注釋信息顯示，SiDDOST編碼1個(gè)48 kDa寡糖轉(zhuǎn)移酶（OST）復(fù)合體亞基，參與催化糖基化反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，糖基化修飾能夠精確地調(diào)控活性激素的含量，除乙烯外，其他多種激素均發(fā)現(xiàn)了它們的糖苷物[20-22]。在擬南芥中，過(guò)量表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT73C5導(dǎo)致植株缺乏油菜素內(nèi)酯并積累油菜素內(nèi)酯糖苷物質(zhì)，而抑制UGT73C5表達(dá)的株系沒(méi)有檢測(cè)到油菜素內(nèi)酯糖苷物。這表明油菜素內(nèi)酯糖基轉(zhuǎn)移酶是由糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT73C5表達(dá)產(chǎn)生的[23]。激素調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、分裂和伸長(zhǎng)、維管組織分化、器官分化和極性建成、植物對(duì)外部環(huán)境的反應(yīng)，因此植物激素參與植株從胚胎發(fā)育、根系形成、葉發(fā)育、花序分枝、花發(fā)育、結(jié)實(shí)整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程的調(diào)控[24]。筆者推測(cè)，SiDDOST通過(guò)調(diào)控激素含量來(lái)影響谷子生長(zhǎng)發(fā)育。將水稻糖基轉(zhuǎn)移酶基因GT43B在擬南芥上過(guò)表達(dá)，T2代轉(zhuǎn)基因植株比野生型有更早的抽苔時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間，果莢數(shù)比野生型減少，但千粒質(zhì)量增加[25]。以上結(jié)果說(shuō)明，水稻糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)開(kāi)花時(shí)間和生殖器官生長(zhǎng)發(fā)育均有調(diào)控作用。在前期的研究中，課題組發(fā)現(xiàn)，SiDDOST基因位于谷子穗分支數(shù)關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)。單倍型分析表明，SiDDOST基因不同單倍型間穗分支數(shù)差異顯著。這初步表明該基因與穗分支數(shù)相關(guān)。本研究從穗分支數(shù)較多的谷子農(nóng)家品種毛毛亮中首次克隆了SiDDOST基因完整cDNA序列，并成功構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體，為進(jìn)一步揭示SiDDOST對(duì)穗分支數(shù)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

3.2 結(jié)論

目前，有關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶在谷子穗部性狀調(diào)控中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道?；谇捌诎l(fā)現(xiàn)，在谷子穗分支數(shù)關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)存在1個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因，有必要克隆該基因，并進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證。本研究首次從穗分支數(shù)高的谷子農(nóng)家品種，毛毛亮中成功克隆了糖基轉(zhuǎn)移酶基因SiDDOST。該基因CDS區(qū)為1 296 bp，編碼432個(gè)氨基酸，成功構(gòu)建了pCAMBIA3301-SiDDOST重組表達(dá)載體，為驗(yàn)證該基因?qū)茸铀敕种?shù)的調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ)。

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