[摘要]目的：本研究旨在證明由馬齒莧、苦參、獐芽菜和玉蘭花四種中草藥提取物組合而成的復合物（Portulaca oleracea， sophora flavescens ait， swertia and magnolia complex，PSSM）以及含有PSSM基礎配方產(chǎn)品具有抗過敏和抗炎活性。方法：本研究采用CCK-8法測定PSSM對RBL-2H3細胞增殖速率的影響，并結合紫外吸收法和酶聯(lián)免疫吸附法測定PSSM對RBL-2H3細胞中β-HEX釋放率、細胞組胺水平和TNF-α水平的影響；采用小鼠耳腫脹試驗和背部炎癥試驗驗證含PSSM的基礎配方產(chǎn)品對遲發(fā)性過敏和接觸性皮炎的緩解作用。結果：一定體積濃度范圍內(nèi)的PSSM對RBL-2H3細胞的增殖沒有影響，PSSM和PSSM基礎配方產(chǎn)品在抗敏和抗炎上均有顯著效果，其中2% PSSM和2% PSSM基礎配方產(chǎn)品效果最佳，2% PSSM對RBL-2H3細胞中β-HEX釋放的抑制率可達47.1%。結論：一定濃度的PSSM及其基礎配方產(chǎn)品在抗敏和抗炎癥上有顯著效果，可為純天然化妝品原料開發(fā)提供參考。

[關鍵詞]中草藥；提取物；化妝品；抗過敏；抗炎癥；馬齒莧；苦參；獐芽菜；玉蘭花

[中圖分類號]R285.5" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2024）12-0001-06

Study on Anti-allergic and Anti-inflammatory Effects of Four Extracts of Chinese Herbal Medicine

CHEN Zhixiong， HONG Ni， CAO Ping， YAN Cui， BAI Shanshan

（ Ramp;D Center， Huzhou Jahen Industrial Co.，Ltd.， Huzhou 313013， Zhejiang， China ）

Abstract： Objective" The aim of this study was to demonstrate that a complex composed of four Chinese herbal extracts （Portulaca oleracea， sophora flavescens ait， swertia and magnolia complex， PSSM） and products containing PSSM based formulations have anti-allergic and anti-inflammatory activities. Methods" In this study， CCK-8 assay was used to determine the effect of PSSM on the proliferation rate of RBL-2H3 cells. Additionally， the effects of PSSM on the β-HEX release rate， cellular histamine levels， and TNF-α horizontal impact in RBL-2H3 cells were measured by ultraviolet absorption and enzyme-linked immunosorbent assay techniques. The efficacy of PSSM and PSSM-containing basic formula products in alleviating delayed allergy and contact dermatitis was assessed through the utilization of the mouse ear swelling test and back inflammation test. Results" Within a specific range of volume concentration， the presence of PSSM does not exhibit a significant effect on the proliferation of RBL-2H3 cells. However， both PSSM and its basic formula products demonstrated noteworthy effects on allergy and anti-inflammatory properties. Notably， among these products， those containing 2% PSSM and 2% PSSM basic formula exhibited the most favorable outcomes. Specifically， the inhibition rate of 2% PSSM β-HEX release reached an impressive 47.1%. Conclusion" The application of a specific concentration of PSSM and its basic formula cosmetics have notable anti-allergy and anti-inflammatory effects. These findings can offer valuable insights for the advancement of Chinese herbal cosmetic ingredients.

Key words： Chinese herbal extract; cosmetics; anti-allergic; anti-inflammatory; portulaca oleracea; sophora flavescens ait; swertia; magnolia complex

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高及化妝品的普及，使得護膚已成為全社會關注的熱點。然而，在化妝品的研發(fā)和制造過程中，常常會加入一些化學成分，這些成分成為皮膚過敏的重要誘因。此外，由于許多人對自身皮膚狀況缺乏足夠的了解，往往導致化妝品的誤用，從而引發(fā)過敏反應。因此，研究天然產(chǎn)物的提取及其抗過敏效果，已成為當前化妝品行業(yè)的發(fā)展趨勢。作為中醫(yī)的發(fā)源地，我國擁有豐富的中草藥資源，這些中藥的應用已逐步延伸至保健品、食品及化妝品等多個領域［1]。中草藥化妝品以其深厚的中醫(yī)理論為基礎，采用純天然、環(huán)保的中草藥作為主要成分，因而具備綠色、安全和高效等諸多優(yōu)點。從中草藥中提取的多糖、多酚、黃酮、萜烯等成分已被廣泛應用于具有保濕、祛斑和美白等功能的化妝品中，而中藥復方的不同成分能夠通過協(xié)同作用，展現(xiàn)出更加強大的功效［2]。

馬齒莧（Portulaca oleracea）是一種藥食同源植物，具有清熱解毒、涼血止血等功效。研究表明，馬齒莧含有黃酮類、多糖、生物堿、萜類等多種成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌等藥理活性［3-5]。其中黃酮類和多糖具有顯著的抗菌和抗氧化作用，能抑制體內(nèi)常見細菌和清除自由基［6]。Zhuang S等［7]發(fā)現(xiàn)，馬齒莧中β-谷甾醇等活性成分可以通過TLR4/κB信號通路來減輕炎癥反應。尹淑紅等［8]利用馬齒莧提取物護膚品和常規(guī)治療方法對尋常性痤瘡治療臨床效果進行探討，馬齒莧提取物護膚品可以有效地輔助尋常性痤瘡治療，對尋常性痤瘡患者的治療有著積極的意義?？鄥ⅲ⊿ophora flavescens Ait.）屬于豆科槐屬植物，是傳統(tǒng)的中藥材，含有生物堿類、三萜皂苷類等抗氧化、抗炎、抗菌等藥理活性。錢利武等［9]在醋酸所致的昆明種小鼠模型中發(fā)現(xiàn)槐果堿等苦參類生物堿均具有較好的抗炎活性。范紅艷等［10]研究發(fā)現(xiàn)苦參總黃酮能提高衰老小鼠腦組織中SOD和Na+-K+-ATP酶活性，降低腦組織中單胺氧化酶B（MAO-B）的活性、MDA及TNF-α含量，最終達到增強抗氧化作用。獐牙菜屬植物歸屬于龍膽科，含有黃酮類環(huán)烯醚萜類及三萜類等化學成分，有降血糖、抗炎、抗病毒等活性。王新強等［11]研究發(fā)現(xiàn)獐牙菜苦苷通過抑制NLRP3炎癥小體，發(fā)揮抗炎功效。玉蘭花作為木蘭科木蘭屬植物，其活性成分在抗炎、抗過敏、抗氧化等功效上同樣可觀［12]。李小莉等［13]研究證明，玉蘭花中的揮發(fā)油具有顯著拮抗HA和Ach的作用。王文魁等［14]研究表明玉蘭花中的揮發(fā)油能抑制炎癥組織中組胺的產(chǎn)生。

因此，本研究從提取馬齒莧、苦參、獐牙菜和玉蘭花四種中草藥活性物質(zhì)并組成復合物（PSSM）出發(fā)，用體外細胞模型探討其抗敏、抗炎作用。并將水、黃原膠、甘油、GTCC、尼甲、A165、EMT10、鯨蠟硬脂醇、聚二甲基硅氧烷和PSSM按照一定配方比例制備成產(chǎn)品，用體內(nèi)小鼠模型研究含有PSSM基礎配方產(chǎn)品是否同樣具有抗敏和抗炎效果。

1" 材料和方法

1.1 主要材料及設備：CO2培養(yǎng)箱bluepard（上海一恒科學儀器有限公司）；多功能酶標儀MULTISKAN（賽默飛世爾科技有限公司）；倒置生物顯微鏡（奧林巴斯中國有限公司）；離心機TDL-60C（上海安亭科學儀器廠）；主要實驗試劑均購買于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 制備PSSM：先稱量一定量的馬齒莧和苦參粉末，在80℃～90 ℃外循環(huán)提取，濾紙過濾，再經(jīng)活性炭脫色，最后濃縮得到A液；再稱量一定量的日本獐牙菜和玉蘭花粉末，滲漉提取，離心濃縮后經(jīng)D101層析精制得到B液；A液和B液按一定比例混合后滅菌，最終得到復合物PSSM。以獐牙菜苦苷作為提取物的定性和定量指標，通過HPLC檢測，提取物中獐牙菜苦苷的濃度可達到2 000 pp，提取方法和工藝保持穩(wěn)定。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組：RBL-2H3（Rat basophilic leukemia cells，RBL-2H3）細胞使用DMEM培養(yǎng)液（含體積分數(shù)1%的青-鏈霉素，體積分數(shù)10%的胎牛血清）在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，當細胞生長到80%左右時，采用濃度為0.25%的胰酶進行消化，并用手持自動細胞計數(shù)器計數(shù)，最后制備一定濃度的細胞懸液傳代培養(yǎng)。取出處于對數(shù)生長周期的RBL-2H3細胞，消化制備成細胞懸液，用DMEM培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整至（4～5）×105 cells/ml加入細胞96孔板中，每組設置3個復孔。設置空白對照組（不加入C48/80和樣品）、C48/80模型組（終濃度10μg/ml，處理20 min）和樣品實驗組，其中樣品實驗組細胞每組先用一定濃度（V/V）的抗敏劑（0.125、0.25、0.5、1、2、4）處理24 h后，倒掉樣品再用無菌PBS清洗3遍，再加入終濃度為10μg/ml的C48/80處理20 min，冰浴10 min，最后收集各組中的上清液，37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min后各孔中加入含10%的CCK-8培養(yǎng)基溶液100μl，恒溫箱避光孵育2 h，輕微震蕩，在酶標儀上于450 nm檢測各孔吸光值，并按下面公式計算細胞活性。細胞活性（%）=實驗組A450/對照組A450×100%。

1.4 細胞脫顆粒釋放β-HEX測定：按照上述1.3方法進行實驗分組和C48/80處理，并收集細胞上清液，每孔取50μl加入96孔板中，加入50μl的顯色液，37 ℃孵育1 h后，加入200μl終止液終止反應，最后在酶標儀上于405 nm讀取各組的吸光值，并按下面公式計算β-HEX釋放抑制率。β-HEX釋放抑制率（%）=（1-實驗組A450/對照組A450）×100%。

1.5 細胞組胺釋放測定：按上述1.3方法進行細胞分組，并收集細胞上清液，各組實驗的組胺測定方法嚴格按照人組胺酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書操作。

1.6 細胞TNF-α釋放測定：按上述1.3方法進行細胞分組，并收集細胞上清液，各組實驗的TNF-α測定方法嚴格按腫瘤壞死因子TNF-α測試盒說明書操作。

1.7 背部炎癥測試：將50只昆明種（Kun Ming，KM）小鼠，隨機分成5組，雌雄各半。第一組為空白組；第二組為模型組；第三組為陽性對照組（地塞米松磷酸鈉注射液）；第四、五組分別為1%和2%濃度配方樣品組。給藥方法見表1。連續(xù)給藥15 d，使用1-氯-2，4-二硝基甲苯（DNCB）誘發(fā)小鼠接觸性皮炎，在實驗第1天、第2天分別注射50μl 7% DNCB在背部激發(fā)一次，第6天、第8天注射25μl 0.5% DNCB第二次激發(fā)，第10、12和14天注射50μl 1% DNCB第三次激發(fā)。實驗結束將小鼠麻醉（5%水合氯醛）并注射魯米諾鈉鹽10 min后做活體成像測試，脫頸處死小鼠后取背皮進行切片病理觀察，并打孔稱重和測量厚度。本實驗由華東理工大學藥學院支持，倫理委員會的批準文號為ECUST-2023-001。腫脹抑制率（%）=（模型組-給藥組）/（模型組-空白組）×100%。

1.8 水腫重量和抑制率測定：將40只KM小鼠，隨機分成4組，每組10只，雌雄各半。第一組為空白組；第二組為模型組；第三組為陽性對照組（地塞米松磷酸鈉注射液）；第四組為2%濃度配方樣品組。給藥方法見表2，連續(xù)給藥7 d，使用1-氯-2，4-二硝基甲苯（DNCB）誘發(fā)小鼠遲發(fā)性過敏，在實驗第1天、第2天分別使用5% DNCB腹部致敏一次，第6天用1% DNCB右耳激發(fā)，第7天給藥1 h后脫頸處死小鼠剪下左右耳，打孔稱重計算腫脹度及抑制率。并進行切片病理觀察，成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件測量表皮厚度。本實驗由華東理工大學藥學院支持，倫理委員會的批準文號為ECUST-2023-001。腫脹抑制率（%）=（模型組腫脹度-樣品組腫脹度）/模型組腫脹度×100%。

1.9 統(tǒng)計學分析：實驗數(shù)據(jù)以GraphPad Prism 9軟件計算，結果以xˉ±s表示，不同實驗條件下比較均采用齊性方差t檢驗，再用One-Way ANOVA成數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2" 結果

2.1 PSSM對RBL-2H3細胞增殖活性的影響：肥大細胞是過敏反應中的效應細胞，在過敏性皮膚病和炎癥反應中發(fā)揮重要的作用，其中RBL-2H3具有肥大細胞的多種生物學特性，因此在很多抗敏實驗中，RBL-2H3常被用作肥大細胞體外實驗的替代模型[15]。PSSM對RBL-2H3細胞活性影響見圖1，PSSM在0.125%～4%濃度范圍內(nèi)，細胞生長活性均在95%以上，呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的狀態(tài)，說明在此體積濃度范圍內(nèi)PSSM對RBL-2H3細胞的增殖沒有影響，后續(xù)的功效實驗結果具有可靠性。

2.2 PSSM對RBL-2H3細胞脫顆粒釋放β-HEX的影響：β-HEX是RBL-2H3細胞脫顆粒的主要研究介質(zhì)，當RBL-2H3受到刺激后脫顆粒釋放的β-HEX會分解對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷，在405 nm處有吸光值，從而算出β-HEX的釋放率[16]。對β-HEX釋放抑制效果越好，則表明抗敏效果越好。從圖2中可以看出，在體積濃度為0.125%～4%范圍內(nèi)，PSSM對RBL-2H3脫顆粒釋放β-HEX均具有一定抑制作用。在體積濃度為0.125%～2%內(nèi)，PSSM對RBL-2H3脫顆粒釋放β-HEX抑制率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，并在濃度為2%時達到頂峰；當體積濃度超過2%時，β-HEX抑制率有所下降。

2.3 PSSM對RBL-2H3細胞釋放組胺的影響：RBL-2H3細胞脫顆粒時會合成組胺，是與Ⅰ型過敏反應急性期有關的最具特征的活性物質(zhì)，是RBL-2H3細胞脫顆粒的標志[17]。從圖3中可以看出C48/80模型組的組胺含量為（17.84±0.84）μg/L，與空白對照組（2.66±0.26）μg/L相比含量增加，差異具有極顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.0001），表明C48/80誘導組胺釋放模型建立成功。PSSM體積濃度為1%和2%的實驗組的組胺含量分別為（6.85±0.68）μg/L、（6.09±0.30）μg/L，與模型組相比，兩組實驗組的組胺含量明顯下降，同樣具有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001）。

2.4 PSSM對RBL-2H3細胞釋放TNF-α的影響：當皮膚發(fā)生過敏時，引發(fā)細胞相關因子的釋放，免疫反應被激活，從而激發(fā)炎癥反應；TNF-α是炎癥反應中一種重要的促炎因子，具有活化T細胞，促進炎癥部位的氧化應激，間接誘導發(fā)熱，引發(fā)其它炎癥因子的釋放等作用[18]。由圖4可知，C48/80模型組的TNF-α含量最高為（56.56±1.55） pg/ml，與空白對照組（20.14±1.70） pg/ml相比差異有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.0 001），表明C48/80誘導TNF-α釋放模型建立成功；PSSM體積濃度為1%和2%的實驗組釋放TNF-α含量分別為（24.67±1.54 ）pg/ml和（24.42±2.26） pg/ml，與C48/80模型組相比，實驗組的TNF-α含量顯著性降低（P＜0.0 001），C48/80模型組TNF-α含量是實驗組的2.3倍。

2.5 PSSM基礎配方產(chǎn)品對DNCB 致小鼠接觸性皮炎的影響：化妝品皮炎是一種特殊的接觸性變態(tài)反應性皮炎，臨床表現(xiàn)主要為皮膚紅腫、紅斑及水皰，嚴重者出現(xiàn)糜爛、滲出及結痂，伴有刺癢或灼燒感等[19]?；瘖y品成分復雜，其引起的皮炎原因眾多，發(fā)病機制也較為復雜，藥物治療效果不完全，長期使用還伴有不良反應風險[20]。因此非藥物治療抗接觸性皮炎可能是一種新的干預手段[21]。1%和2%的PSSM基礎配方產(chǎn)品均能有效抑制背皮炎癥，其中2% 濃度的效果要優(yōu)于1%濃度，這與上述結論保持一致（見表3）。此外觀察圖5的活體成像影像也可以發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，1%和2% 的PSSM基礎配方樣品組均能抑制背皮炎癥引起的腫脹，其中2% PSSM基礎配方樣品組的抗炎效果與陽性對照組（0.5%地塞米松磷酸鈉）效果接近，說明2% PSSM基礎配方產(chǎn)品對小鼠具有明顯的抗炎作用。

2.6 PSSM基礎配方產(chǎn)品對DNCB致小鼠遲發(fā)性過敏的影響：從小鼠背部炎癥實驗發(fā)現(xiàn)，2% PSSM基礎配方產(chǎn)品抗炎效果顯著，在此基礎上，再次采用體外實驗針對2% PSSM基礎配方產(chǎn)品的抗過敏體效果進行進一步挖掘和探索。從表4可以看出模型組腫脹度最高，且耳表皮厚度損壞無法測量，說明1-氯-2，4-二硝基甲苯（DNCB）可誘發(fā)小鼠遲發(fā)性過敏，模型建立成功。其中2% PSSM基礎配方產(chǎn)品能顯著的抑制遲發(fā)性過敏引起的腫脹，是地塞米松磷酸鈉注射液效果的60%。觀察圖6各組病理切片可見，模型組切片組織少量表皮細胞細胞核染色變淡，嗜堿性變?nèi)?，結構不清，局部表皮可見少許壞死物，真皮層可見個別中性粒細胞浸潤，部分毛細血管充血。而2% PSSM基礎配方樣品組的組織表皮輕度增厚和角化，可見個別的中性粒細胞浸潤。從40倍顯微鏡照片測量表皮厚度結果也可以看到，2% PSSM基礎配方產(chǎn)品治療的鼠耳厚度與空白組和陽性對照（0.5%地塞米松磷酸鈉）相近，同樣證明了其有顯著的抗過敏作用。

3" 討論

在過去的幾十年里，皮炎以及皮炎導致過敏的治療效果一直不佳，全球患病率也不斷在上升[22]，盡管治療方式不斷進步，但仍影響著15%～25%的兒童和1%～3%的成年人的生活質(zhì)量[23]。PSSM是由四種草藥組合而成，包括馬齒莧（Portulaca oleracea），苦參（Sophora flavescens Ait），獐牙菜屬（Swertia）和玉蘭花（Mangnolia）。這四種草藥均富含生物堿、類黃酮和多糖等化合物，具有抗炎、抗氧化、抗微生物以及抗腫瘤等多種藥理活性。值得注意的是，本研究結果清楚地表明，PSSM以及添加了PSSM的產(chǎn)品通過抑制TNF-α、組胺釋放以及肥大細胞脫顆粒釋放，能夠有效改善接觸性皮炎和遲發(fā)性過敏的皮膚損傷癥狀。DNFB誘導的小鼠模型具有簡單、可重復性高的優(yōu)點，對評估治療皮炎和過敏潛在效果方面具有很大的價值。本研究通過DNFB誘導的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，PSSM以及添加了PSSM的產(chǎn)品可以起到干預和改善皮膚炎癥和過敏的癥狀。Kim H[24]研究報道稱，在DNFB誘導的小鼠模型中，苦參提取物能夠阻止單個核細胞和MCs的浸潤，具有減輕耳腫脹和耳增生的作用。另外Hong MH等[25]報道苦參可通過降解IKBα的磷酸化來抑制NF-kB的核易位，從而用于治療肥大細胞源過敏性炎癥。Zeng HR等[26]的研究結果表明，復合中草藥VYAC可以抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，阻斷肥大細胞脫顆粒，從而達到治療接觸性皮炎的目的。這些結果都證明了單一中草藥或復合中草藥對緩解炎癥減輕過敏都能起到一個很好的效果。

傳統(tǒng)中草藥被用作補充或替代醫(yī)學，盡管它被定義為一種沒有科學依據(jù)或證明有效的治療形式[27]，但它在目前市場上越來越受歡迎。本研究表明，PSSM在消炎抗過敏方面的效果顯著，是一種很有希望且溫和的消炎止敏新途徑。此外，本研究的局限性在于尚未進行皮炎和過敏的機制研究，為了解決這個問題，未來的研究將需要確定PSSM改善炎癥和過敏的機制，為皮炎和過敏的更深層次治療帶來新途徑。

本研究旨在探索中草藥復合物PSSM和含有PSSM產(chǎn)品的抗過敏和抗炎癥效果。從體外細胞實驗和體內(nèi)小鼠實驗結果都表明，PSSM能夠起到很好的抗過敏和抗炎效果，其產(chǎn)品具有同樣的效果。其中體積濃度為1%和2% PSSM對RBL-2H3細胞β-HEX釋放抑制率分別為45.5%和47.1%，當體積濃度超過2%時，β-HEX抑制率有所下降。這可能是因為過高濃度的PSSM對細胞會起到一定的毒害作用，導致β-HEX釋放率增加而抑制率降低。同時C48/80誘導的RBL-2H3細胞經(jīng)過1%和2% PSSM處理后，組胺含量分別降低到（6.85±0.68 ）μg/L和（6.09±0.30 ）μg/L，TNF-α含量分別降低到（24.67±1.54） pg/ml和（24.42±2.26 ）pg/ml，與C48/80模型組相比，兩組實驗組抗炎抗過敏效果顯著，且2%濃度達到最佳效果。同樣地1%和2% PSSM基礎配方產(chǎn)品對小鼠腫脹度均能夠有所緩解，尤其是2% PSSM基礎配方產(chǎn)品的抗遲發(fā)性過敏的效果是地塞米松磷酸鈉注射液效果的60%，在抗炎效果上也與之相接近。這不僅為開發(fā)天然溫和抗敏抗炎化妝品提供了一個數(shù)據(jù)支撐，更為將中草藥提取物應用于化妝品行業(yè)帶來新的生命和活力，使化妝品產(chǎn)品開發(fā)更具功能化、實用化和安全化。但目前存在對天然成分的化妝品制備工藝研究較淺，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。需要進一步優(yōu)化工藝、完善制度，共同去打造優(yōu)良中草藥化妝品市場。

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[收稿日期]2023-09-07

本文引用格式：陳志雄，洪妮，曹平，等.四種中草藥提取物抗過敏和抗炎癥效果研究[J].中國美容醫(yī)學，2024，33（12）：1-6.