[摘要]目的：探究花椒天然成分WGX-50配制劑的保濕性能及對皮膚屏障功能的影響。方法：以角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和16例皮膚狀態(tài)良好的受試者為研究對象。HaCaT細(xì)胞用于測試WGX-50的細(xì)胞毒性，分析WGX-50對水通道蛋白3（Aquaporin 3，AQP3）、聚角蛋白微絲蛋白（Filaggrin）、閉合蛋白（Claudin-1）、透明質(zhì)酸合成酶2（Hyaluronic acid synthase 2，HAS2）和CD44表達(dá)水平的影響；測試WGX-50對人體皮膚屏障功能的影響。結(jié)果：0.5μmol/L花椒素WGX-50促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖（P＜0.05），1.0～100.0μmol/L WGX-50抑制HaCaT細(xì)胞活性，細(xì)胞活性均低于對照組（P＜0.05），尤其高濃度（≥10μmol/L）WGX-50對HaCaT細(xì)胞活性抑制作用更顯著（P＜0.01）。0.5μmol/L的WGX-50能有效促進(jìn)AQP3基因表達(dá)（P＜0.05），但對Filaggrin、Claudin-1、HAS2、CD44基因表達(dá)水平無明顯影響（P＞0.05）。皮膚水分含量和經(jīng)表皮水分散失速率實(shí)驗(yàn)顯示，花椒素WGX-50對皮膚具有良好的保濕效果。結(jié)論：低濃度花椒素（0.5μmol/L）WGX-50可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，增強(qiáng)HaCaT細(xì)胞內(nèi)AQP3基因表達(dá)，改善人體皮膚屏障功能。

[關(guān)鍵詞]花椒素；皮膚屏障功能；保濕；含水量；表皮失水率

[中圖分類號]R285" " [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2024）12-0006-04

Effects of Natural Component of Zanthoxylum Xanthoxylum （WGX-50） on Moisture Retention and Skin Barrier Function

HE Yanni1， LI Haiyang1， ZENG Yibin1， WANG Heng2， WEI Dongqing3

[ 1.Department of Dermatology， Minhang Hospital Affiliated of Fudan University （ Shanghai Minhang District Central Hospital ）， Shanghai 201199， China; 2.Department of Food Science amp; Technology， School of Agriculture and Biology， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240， China; 3.State Key Laboratory of Microbial Metabolism and School of Life Sciences and Biotechnology， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240， China ]

Abstract： Objective" To study the moisturizing properties of the natural component of Zanthoxylum WGX-50 and its effect on skin barrier function. Methods" Keratinocyte HaCaT and 16 subjects with good skin condition were studied. HaCaT cells were used to test the cytotoxicity of WGX-50， and the effects of WGX-50 on the expression levels of aquaporin 3 （AQP3）， Filaggrin， Claudin-1， hyaluronic acid synthetase 2 （HAS2） and CD44 were analyzed. Subjects were used to test the effects of WGX-50 on skin barrier function. Results" 0.5 μmol /L WGX-50 promoted HaCaT cell proliferation （P＜0.05）， and 1.0-100.0 μmol /L WGX-50 inhibited HaCaT cell activity， and the cell activity was lower than that of control group （P＜0.05）. In particular， high concentration of WGX-50 （≥10 μmol/L） significantly inhibited the activity of HaCaT cells （P＜0.01）.0.5 μmol/L WGX-50 could effectively promote AQP3 gene expression （P＜0.05）， but had no significant effect on Filaggrin， Claudin-1， HAS2 and CD44 gene expression levels （P＞0.05）. Experiments on skin moisture content and transepidermal moisture loss rate showed that xanthoxylin WGX-50 had good moisturizing effect on skin. Conclusion" Low concentration of xanthoxylin （0.5μmol /L） WGX-50 can promote the proliferation of HaCaT cells， enhance the expression of AQP3 gene in HaCaT cells， and improve the function of human skin barrier.

Key words： xanthoxylin; skin barrier function; moisturize; water content; epidermal water loss rate

隨著物質(zhì)生活水平的提高和人們對美的追求不斷增強(qiáng)，化妝品已成為人們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵泛拖钠??；ń匪豔GX-50是花椒中特有的小分子天然產(chǎn)物，具有良好的抗炎、抗氧化作用?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，花椒素WGX-50不僅具有神經(jīng)保護(hù)、心臟保護(hù)作用[1]，還具有皮膚抗衰老功效[2]。此外，魏冬青教授團(tuán)隊(duì)通過大量研究發(fā)現(xiàn)，花椒素WGX-50能有效促進(jìn)小鼠皮膚膠原蛋白、彈性蛋白和毛囊再生修復(fù)，調(diào)節(jié)皮膚衰老相關(guān)信號通路NF-κB，促使皮膚保持年輕狀態(tài)及已衰老皮膚年輕化[3]。提示花椒素WGX-50在促進(jìn)皮膚修復(fù)和抗衰老方面有著出色表現(xiàn)，可用于化妝品制備中。關(guān)于花椒素WGX-50是否還具有其他未被發(fā)現(xiàn)的新用途，能更好實(shí)現(xiàn)其商業(yè)價(jià)值，仍有待研究。保濕是做好皮膚管理的基礎(chǔ)，皮膚缺水會(huì)影響角質(zhì)細(xì)胞正常代謝，造成毛孔粗大、皮膚干燥敏感、膚色暗沉、色斑、皺紋等皮膚問題出現(xiàn)。做好皮膚保濕護(hù)理，對于保持皮膚彈性和光澤、增強(qiáng)皮膚屏障功能等均具有重要意義[4]。本研究預(yù)通過保濕性實(shí)驗(yàn)、皮膚水分含量、經(jīng)表皮水分散失速率、保濕基因測試，對花椒素WGX-50保濕性能和皮膚屏障功能進(jìn)行考察，以期為花椒素WGX-50在化妝品開發(fā)中的應(yīng)用提供更多依據(jù)。

1" 材料和方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象：本次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT，購自上海雅吉生物科技有限公司。同時(shí)收集皮膚狀況良好且無化妝品過敏史的女性和男性各8例為皮膚屏障功能測試對象，其中女性平均年齡33（22～42）歲，男性平均年齡32（23～40）歲。

1.1.2 試劑和儀器：①主要試劑：花椒素WGX-50（純度98%，Myland）、噻唑藍(lán)（MTT，Sigma）、二甲基亞砜（DMSO，Sigma）、DMEM培養(yǎng)基（廣東博溪）、NBS（四季青）、Medium-254（Gibco）、HMGS（Gibco）、KC2500（廣東博溪）、地塞米松（Sigma）、TGF-β1（PEPROTECH）、RNAiso Plus（TaKaRa）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）、熒光染料（TaKaRa）、胎牛血清（GIBCO，500 ml）。②主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（Thermo）、超凈工作臺（蘇凈安泰）、微量振蕩器（其林貝爾）、酶標(biāo)儀（BioTek）、倒置顯微鏡（OLYMPUS IX73），離心機(jī)（eppendorf，Centrifuge 5810 R），96孔板（Corning），T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶（COSTAR，430168），細(xì)胞檢測板（E-plate16），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI7900）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT培養(yǎng)于內(nèi)含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中，做傳代培養(yǎng)，形成單個(gè)細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)接種至96孔板中，每孔接種5 000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞分為空白對照組（Control）、PC組和WGX組，其中對照組不做任何處理，PC組用0.05%二甲基亞砜（DMSO）處理，WGX組分別用0.5 μmol/L、1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的花椒素WGX-50處理，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)3 d，每孔加入20 μl MTT溶液繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。酶標(biāo)儀于490 nm處測定培養(yǎng)物吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.2 保濕基因測試：取傳代培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞，轉(zhuǎn)接至96孔板中，分為空白對照（BC）組和WGX-50組，BC組不做任何處理；依據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，WGX組用0.5 μmol/L的花椒素WGX-50處理，兩組細(xì)胞均于37℃的CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h后，收集細(xì)胞樣本。依據(jù)RNA提取試劑盒、cDNA試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書，開展細(xì)胞RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測保濕相關(guān)基因水通道蛋白3（AQP3）、聚角蛋白微絲蛋白（Filaggrin）、閉合蛋白（Claudin-1）、透明質(zhì)酸合成酶2（HAS2）和CD44的表達(dá)量，采用2-△△CT方法計(jì)算各目標(biāo)基因的相對表達(dá)水平。

1.2.3 皮膚屏障功能測試：邀請受試者進(jìn)入相對濕度為（50±5）%，室溫為（21±1）℃的恒濕恒溫測試間，選擇右前臂內(nèi)側(cè)為測試部位，測試前30 min對測試部位做徹底清潔，紙巾擦干水分，靜坐于測試間等待測試。在測試部位劃分為3個(gè)區(qū)域?yàn)闇y試區(qū)（各區(qū)域面積為3 cm×3 cm），分別標(biāo)記為對照組（增稠劑）、甘油組（10%甘油+增稠劑）和WGX組（0.5 μmol/LWGX-50+增稠劑），用相同涂抹方式，按照（2.0±0.1）mg/cm2劑量將甘油和花椒WGX-50均勻涂抹于相應(yīng)測試區(qū)，對照組涂抹相同濃度的增稠劑。應(yīng)用MoistureMeter SC MSC1201皮膚水分測試儀和Vapometer SWL5210經(jīng)皮水分流失測試儀分別于測試前（0 h）和測試樣品涂抹后1 h、2 h、3 h、4 h時(shí)各標(biāo)記處皮膚水分含量和表皮水分散失量率（TEWL），每個(gè)測試區(qū)選擇5個(gè)測試點(diǎn)，取5個(gè)測試點(diǎn)的平均值[5-6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 22.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（xˉ±s）描述，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組或三組以上組間相同時(shí)間內(nèi)比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1 花椒素WGX-50對HaCaT細(xì)胞的毒性測試結(jié)果比較：0.5 μmol/L花椒素WGX-50組HaCaT活力與對照組比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.322，P＜0.05）。1.0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L花椒素WGX-50使HaCaT細(xì)胞活性降至93.0%左右，WGX-50濃度≥25 μmol/L時(shí)細(xì)胞活性降至66.77%～50.36%，與對照組比較，花椒素1.0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L、25.0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L組和PC組HaCaT細(xì)胞活性均明顯下降（t=8.081、6.791、8.229、6.498、12.154、20.262、27.121、41.805，P＜0.05）；花椒素WGX-50處理各組HaCaT細(xì)胞活性均明顯高于PC組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=50.382、44.355、58.151、56.819、22.904、13.685、10.122、11.978，P＜0.001）。見圖1。

2.2 花椒素WGX-50對HaCaT細(xì)胞內(nèi)保濕基因表達(dá)情況的影響：與BC組相比，花椒素WGX-50處理的WGX組對HaCaT細(xì)胞內(nèi)AQP3基因的表達(dá)有顯著促進(jìn)作用（t=7.604，P＜0.05），但WGC組對Filaggrin、Claudin-1、HAS2、CD44表達(dá)情況無明顯影響（t=0.307、0.815、0.388、1.162，P＞0.05）。見圖2。

2.3 花椒素WGX-50對人體皮膚水分含量的影響：三組測試0 h（測試前）皮膚水分含量間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.824，P＞0.05），做不同處理后1 h、2 h、3 h、4 h時(shí)甘油組和WGX組受試者皮膚水分含量均明顯高于對照組，且WGX組在處理后2 h時(shí)皮膚水分含量明顯高于甘油組（t=3.697、2.865、3.604、6.471、4.232、4.567、3.035、5.722、2.193，均P＜0.05），WGX組和甘油組處理后1 h、3 h和4 h時(shí)皮膚水分含量間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.162、0.349、0.619，均P＞0.05）。見圖3。

2.4 花椒素WGX-50對表皮TEWL的影響：三組測試0 h表皮TEWL水平間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.271，P＞0.05），做不同處理后1 h、2 h、3 h、4 h時(shí)甘油組和WGX組受試者表皮TEWL水平均明顯低于對照組（t=3.493、3.266、2.832、4.454、5.491、23.759、11.869、17.364，均P＜0.05），且WGX組在處理后2 h、3 h、4 h時(shí)表皮TEWL水平明顯低于甘油組（t=11.532、11.132、12.298，均P＜0.05）。見圖4。

3" 討論

皮膚是人體最大的器官組織，阻擋各種有害物質(zhì)和病原體入侵損害機(jī)體，同時(shí)預(yù)防體內(nèi)水分、營養(yǎng)物質(zhì)等流失的天然屏障。隨著社會(huì)進(jìn)步和國民生活水平提高，人們對外在形象關(guān)注度越來越高，加之皮膚淺表外露所具有的心理效應(yīng)，致使預(yù)防皮膚衰老、防治各種皮膚問題，逐漸成為人們關(guān)注熱點(diǎn)之一。皮膚缺水是皮膚起皮、瘙癢、疼痛、長痘、長斑、松弛、老化等問題出現(xiàn)的主要原因。各種外界因素作用于皮膚，導(dǎo)致表皮真皮部分水分的大量流失，皮層組織含水量減少，均會(huì)導(dǎo)致皮膚干燥，引發(fā)各種皮膚問題，甚至損傷容貌，不僅嚴(yán)重影響美觀[7]，而且影響患者心理健康[8]。因此，選擇對皮膚溫和、無刺激的護(hù)膚品，做好皮膚補(bǔ)水保濕護(hù)理，改善皮膚缺水問題，成為解決各類皮膚問題的關(guān)鍵。

以天然活性成分為主的各種保濕、美白、抗衰老類護(hù)膚品因毒副作用小、安全性高而備受消費(fèi)者喜愛。花椒是具有悠久食用和藥用歷史的調(diào)味品和中藥，其作為藥物使用具有良好抗菌、抗炎、抗氧化等活性。上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)及虛擬藥物篩選方式獲得一種活性分子WGX-50，通過與中國藥典比對發(fā)現(xiàn)其是花椒中特有成分，故被稱為花椒素?；ń匪豔GX-50屬于α7煙堿乙酰膽堿受體（α7 nAChR）激動(dòng)劑，一方面，其可與目標(biāo)蛋白α7 nAChR結(jié)合，抑制β淀粉樣蛋白對炎癥介質(zhì)釋放的誘導(dǎo)作用，阻止神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)活性[9]；另一方面，其可在α7nAChR激活后，通過脊髓白細(xì)胞介素-10/β-內(nèi)啡肽通路，對疼痛超敏反應(yīng)產(chǎn)生抗痛覺作用[10]。此外，花椒素WGX-50可通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白生成，抑制活性氧生成，從而發(fā)揮抗氧化和抗皮膚衰老作用[3，11]。Wang R等[12]研究顯示，通過兩步乳化法將WGX-50與維生素C（Vc）制備成GX-50-Vc微膠囊，可將抗氧化劑WGX-50和Vc輸送至皮膚深層，達(dá)到抗氧化效果。鑒于花椒素WGX-50這一天然活性成分所有的抗氧化、抗衰老功效，本項(xiàng)目致力于將其應(yīng)用于護(hù)膚品開發(fā)中。

角質(zhì)形成細(xì)胞是組成皮膚表皮的主要細(xì)胞，主要功能是形成皮膚屏障，防止皮膚水分流失或遭受紫外線和各種病原體入侵。本研究以角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT為測試對象，測試花椒素WGX-50對皮膚表皮細(xì)胞的毒性，測試結(jié)果顯示，0.5 μmol/L花椒素WGX-50處理24 h后HaCaT細(xì)胞活力高于空白對照組；1.0～5.0 μmol/L WGX-50處理后HaCaT細(xì)胞活性降至93.0%左右，花椒素WGX-50≥25 μmol/L時(shí)細(xì)胞活性降至50.36%～66.77%；不同花椒素WGX-50處理后HaCaT細(xì)胞活性均明顯低于對照組，但仍顯著高于PC組，說明低濃度花椒素WGX-50對HaCaT細(xì)胞活力具有促增強(qiáng)作用，中高濃度WGX-50均對HaCaT細(xì)胞具有不同程度毒性作用，且當(dāng)WGX-50濃度達(dá)到10 μmol/L時(shí)，其對HaCaT的毒性顯著增大，且毒性隨其濃度增大而顯著增強(qiáng)?？赡茉蛟谟诘蜐舛然ń匪豔GX-50具有抗炎、抗氧化作用，有助于清除細(xì)胞正常代謝增殖所產(chǎn)生的有害物質(zhì)，從而促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞活力；但HaCaT細(xì)胞而言花椒素WGX-50自身也是一種外源性刺激物，濃度過高亦會(huì)成為有害刺激，促使HaCaT細(xì)胞釋放各種促炎介質(zhì)，激活細(xì)胞內(nèi)抗氧化途徑，消耗細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶，增加細(xì)胞內(nèi)炎癥介質(zhì)、ROS等積累，加速細(xì)胞凋亡[13]。APQ3是一種可表達(dá)于皮膚表皮細(xì)胞膜上水通道蛋白，可跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水、甘油等物質(zhì)，其表達(dá)水平容易受紫外線、炎熱、干燥等外界條件刺激而下調(diào)。缺失了APQ3的皮膚表皮含水量會(huì)下降，導(dǎo)致皮膚缺水，皮膚表皮彈性降低、皮膚衰老加快、屏障受損[14]。本研究測試結(jié)果顯示，花椒素WGX-50可促使HaCaT細(xì)胞內(nèi)APQ3上調(diào)表達(dá)，提示花椒素WGX-50對皮膚表皮組織具有保濕效果。

皮膚屏障受損會(huì)導(dǎo)致TWEL加快，皮膚含水量減少，導(dǎo)致皮膚干燥、老化、色素沉著，引發(fā)黃褐斑、皮膚衰老等問題[15]，因此修復(fù)受損皮膚屏障具有重要意義。研究證實(shí)，可選用具有能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖作用，能增強(qiáng)HaCaT細(xì)胞抗氧化能力，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧等氧化劑含量的成分，來加速對皮膚屏障的修復(fù)作用[16]。本研究通過皮膚含水量測試實(shí)驗(yàn)和經(jīng)表皮水分散失率測試實(shí)驗(yàn)表明，花椒素WGX-50能有效促進(jìn)皮膚含水量增加，抑制皮膚水分散失，且效果優(yōu)于相同比例的甘油?？赡茉蛟谟?，甘油特有的多元醇結(jié)構(gòu)具有良好的吸水保濕作用，能鎖住水分，保持皮膚水潤，但不具備細(xì)胞營養(yǎng)作用，故保濕效果有限。花椒素WGX-50一方面能促進(jìn)皮膚表皮細(xì)胞中APQ3上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞對水分的吸收；另一方面可清除細(xì)胞代謝所形成ROS等氧化物，促進(jìn)膠原蛋白形成，后者具有營養(yǎng)、修復(fù)皮膚表皮、真皮細(xì)胞等功效，故保濕效果相對更好。

綜上所述，低濃度花椒素（0.5 μmol/L）WGX-50能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，有效增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)AQP3基因表達(dá)，改善人體皮膚屏障功能，有望用于保濕、抗衰老類護(hù)膚品開發(fā)中。

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[收稿日期]2024-02-26

本文引用格式：賀燕妮，李海洋，曾義斌，等.花椒天然成分花椒素（WGX-50）的保濕性能及對人體皮膚屏障功能的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2024，33（12）：6-10.