摘 要：【目的】研究長(zhǎng)期繼代的紅松胚性愈傷組織（embryogenic callus，EC）非胚性化及體胚（somatic embryogenesis，SE）分化啟動(dòng)的生理特性，探討不同胚性的愈傷組織形態(tài)特征與生理特性對(duì)應(yīng)關(guān)系，為突破紅松體胚發(fā)生中的EC胚性難以保持的技術(shù)瓶頸提供參考。【方法】本研究以紅松長(zhǎng)期繼代獲得的不同類型愈傷組織（分別為繼代2個(gè)月和繼代6個(gè)月的白色、黃色、水漬型、纖維化、褐化、含早期球形胚的愈傷組織）為材料，比較分析不同類型愈傷組織的形態(tài)特征、生理指標(biāo)、體胚分化能力的差異?！窘Y(jié)果】繼代保持2～6個(gè)月獲得的6種類型紅松愈傷組織在顏色、質(zhì)地等外部形態(tài)與組織細(xì)胞學(xué)特征，以及增殖速度與體胚分化能力方面差異明顯，在繼代2個(gè)月的白色高胚性愈傷組織（C1）中觀察到明顯的原胚團(tuán)（PEMs）結(jié)構(gòu)，并且這種類型愈傷組織能分化出球形胚，在其他5種類型的愈傷組織（C2-C6）中觀察到PEMs結(jié)構(gòu)的解體，以及大量形狀不規(guī)則的細(xì)胞和降解的細(xì)胞，未見有球形胚的分化。高胚性的愈傷組織中可溶性糖及淀粉含量最高；高活性POD出現(xiàn)在高胚性的愈傷組織和褐化的愈傷組織中；SOD活性在高胚性的愈傷組織和有球形胚分化的愈傷組織中較低，而在增殖速度快的黃色愈傷中SOD活性較高；有球形胚分化的愈傷組織和低胚性的白色愈傷組織CAT活性最高；水漬型和纖維化的愈傷組織SOD、POD、CAT活性均較低?！窘Y(jié)論】長(zhǎng)期繼代的紅松EC保持胚性或失去胚性以及體胚分化啟動(dòng)過程受細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶和貯藏類物質(zhì)協(xié)同調(diào)控，高含量的可溶性糖和淀粉利于紅松EC維持胚性，SOD、POD、CAT這3種關(guān)鍵酶在不同顏色質(zhì)地的紅松愈傷組織形成中的作用存在差異。

關(guān)鍵詞：紅松；長(zhǎng)期繼代；胚性愈傷組織；形態(tài)特征；生理指標(biāo)

中圖分類號(hào)：S722；Q813 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-923X（2024）11-0049-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31800515）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LH2022C102）；黑龍江省教育廳基本業(yè)務(wù)專項(xiàng)（145109137）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（x202310232028）。

Morphological and physiological characteristics of embryogenic callus of Pinus koraiensis during non embryogenization and initial somatic embryo differentiation

ZHONG Yue， FAN Zhenyu， GUAN Chunyu， CAO Yeping， LI Qingchen， LIANG Yan

（College of Life Sciences and Agriculture and Forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China）

Abstract：【Objective】We investigated the physiological characteristics of non embryogenization and somatic embryogenesis（SE） differentiation initiation in long-term subcultured embryogenic callus （EC） of Pinus koraiensis， explored the correspondence between morphological and physiological characteristics of the different embryogenic potential calli， which can provide a reference for overcoming the technical bottleneck that the embryogenetic potential of EC is difficult to maintain in SE of P. koraiensis.【Method】In this study， different types of calli （white calli subcultured for 2 months and 6 months， yellow calli， water-stained calli， fibrotic calli， browned calli， and calli containing early spherical embryos， respectively ） obtained by long-term subgeneration of . koraiensis were used as materials， and the differences in morphological characteristics， physiological indexes， and somatic embryo differentiation ability of different types of calli were compared and analyzed.【Result】The six types calli of Korean pine obtained by subcultured for 2-6 months had significant differences in external morphological and histocytological characteristics such as color and texture， as well as proliferation rate and somatic embryo differentiation ability. In the 2-month-old white calli with high embryogenic potential （C1）， a distinct proembryogenic masses （PEMs） structure was observed and globular embryos could be differentiated from the C1-type calli， whereas in the other five types of calli （C2-C6）， the disintegration of PEMs structure， a large number of irregularly shaped cells and degraded cells were observed， there were no differentiation of globular embryos from the these 5 types of calli. The results showed that the contents of soluble sugar and starch were the highest in the calli with high embryonic potential， high activity of POD appeared in highly embryonic potential calli and browned calli， the activity of superoxide SOD was lower in the calli with high embryonic potential and the calli with differentiated globular embryos， while the activity of SOD was higher in the yellow calli with fast proliferation rate， the calli with differentiated globular embryos and the white calli with low embryonic potential had the highest CAT activity， the activities of SOD， POD and CAT in water-stained calli and fibrotic calli were low.【Conclusion】The long-term subculture of P. koraiensis EC to maintain embryonic potential or lose embryonic potential and the initiation of somatic embryo differentiation are synergistically regulated by intracellular protective enzymes and storage substances， and the high content of soluble sugar and starch are conducive to the maintenance of embryonic potential of P. koraiensis EC， and the roles of the three key enzymes SOD， POD and CAT in the formation of calli of P. koraiensis with different colors and textures are different.

Keywords： Pinus koraiensis； long-term subculture； embryogenic callus； morphological characteristics； physiological indexes

紅松Pinus koraiensis為裸子植物門松科Pinaceae松屬Pinus常綠樹種，主要分布在日本、韓國(guó)、朝鮮、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，以及我國(guó)東北部長(zhǎng)白山和小興安嶺一帶[1]。紅松是寒溫帶針闊葉混交林的主要建群樹種，也是我國(guó)乃至東亞地區(qū)極其重要的優(yōu)質(zhì)珍貴用材與堅(jiān)果樹種。此外，由于其樹干高大挺拔，紅松也常被用作園林綠化樹種[2]。目前紅松種苗繁育中普遍存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、種子結(jié)實(shí)率低、低齡幼苗死亡率高等問題[3-4]，導(dǎo)致具有優(yōu)良性狀的紅松種苗難以滿足市場(chǎng)需求。若建立體細(xì)胞胚胎發(fā)生（somatic embryogenesis，SE）技術(shù)的快繁體系，可實(shí)現(xiàn)紅松良種繁育的規(guī)模化生產(chǎn)，并滿足市場(chǎng)對(duì)于紅松種苗的大量需求[5]。體胚發(fā)生作為一種快速、高效、穩(wěn)定的繁殖技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源的離體保存、苗木的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、植物基因工程等領(lǐng)域[6]，此外，由于與合子胚發(fā)育過程類似，體胚發(fā)生也作為研究高等植物合子胚發(fā)育早期事件基因表達(dá)調(diào)控的理想模型[7]。

針葉樹體胚發(fā)生通常包括胚性愈傷組織（embryogenic callus，EC）的誘導(dǎo)、增殖與保持、體胚成熟、萌發(fā)與植株再生幾個(gè)階段，其中未分化的體細(xì)胞能否轉(zhuǎn)化成胚性細(xì)胞并長(zhǎng)時(shí)間保持高胚性，直接決定了后期能否成功誘導(dǎo)出體胚[8]。紅松體胚發(fā)生的研究表明，只有處于特定發(fā)育階段和特定基因型的紅松雌配子體，才能成功誘導(dǎo)出高胚性的愈傷組織[2，9]。此外，長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致高胚性的愈傷組織逐漸降低或者失去胚性，這種胚性一旦喪失后很難再逆轉(zhuǎn)[5，9]。由于紅松EC的胚性難以長(zhǎng)期保存，導(dǎo)致開展紅松體胚相關(guān)研究需要反復(fù)重新地誘導(dǎo)EC，這是耗時(shí)又費(fèi)力的，再加上受基因型及外植體特定發(fā)育時(shí)期的影響，導(dǎo)致紅松EC誘導(dǎo)困難。上述問題嚴(yán)重影響了成熟的紅松體胚發(fā)生體系的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化體系的應(yīng)用。因此，紅松EC保持過程中胚性降低的問題，現(xiàn)已成為構(gòu)建成熟、穩(wěn)定、高效的紅松體胚發(fā)生體系急需突破的瓶頸。

課題組在前期研究中，將來源一致、狀態(tài)相同的紅松EC繼代到相同的培養(yǎng)基數(shù)月后，獲得了白色、黃色、纖維化等多種類型的愈傷組織，這些愈傷組織不僅在顏色、質(zhì)地、分散程度等外部形態(tài)特征區(qū)別明顯，而且其體胚分化能力也差異顯著。研究表明植物SE中體細(xì)胞向胚性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、胚性細(xì)胞的非胚性化，以及體胚分化啟動(dòng)的過程均涉及能量貯藏類物質(zhì)的增加或減少、活性氧（ROS）的積累和清除以及抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵指標(biāo)的變化，這些因素協(xié)同調(diào)控體胚發(fā)生過程中細(xì)胞的命運(yùn)和分化的方向[10-11]。為進(jìn)一步明確長(zhǎng)期繼代的紅松胚性愈傷組織非胚性化及體胚分化啟動(dòng)的生理特性，探討不同胚性的愈傷組織形態(tài)特征與生理特性對(duì)應(yīng)關(guān)系十分必要。為此，本研究以繼代保持2～6個(gè)月獲得的不同類型愈傷組織及早期分化出球形胚的愈傷組織為材料，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理指標(biāo)的對(duì)比分析、體胚分化能力的評(píng)估，以期進(jìn)一步明確紅松EC長(zhǎng)期繼代過程不同類型愈傷組織的形成以及體胚啟動(dòng)形態(tài)分化的機(jī)理，該研究在實(shí)踐上可為成熟穩(wěn)定的紅松體胚再生體系的構(gòu)建提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以吉林露水河紅松種子園優(yōu)良無性系（L22）未成熟種子誘導(dǎo)的EC作為初始材料，誘導(dǎo)方法參照Peng等[2]的方法，選取上述狀態(tài)一致的EC每隔2周進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DCR+1 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+4 g/L植物凝膠+0.5 g/L酸水解酪蛋白+0.5 g/L L-谷氨酰胺，pH值調(diào)至5.8，L-谷氨酰胺采用過濾滅菌方式加入。將繼代培養(yǎng)獲得的愈傷組織分為6種類型，分別為2個(gè)月的白色愈傷組織（C1）及6個(gè)月的白色愈傷組織（C2）、黃色愈傷組織（C3）、水漬型愈傷組織（C4）、纖維化愈傷組織（C5）和褐化愈傷組織（C6）。隨后，將上述6種類型愈傷組織進(jìn)行早期體胚分化實(shí)驗(yàn)（不添加任何激素，其他條件同繼代培養(yǎng)條件），于培養(yǎng)7 d時(shí)統(tǒng)計(jì)球形胚分化情況，并將獲得的含早期球狀胚的培養(yǎng)物記為C7型愈傷組織，體胚分化實(shí)驗(yàn)采用10塊愈傷組織（每塊愈傷組織0.5 g），重復(fù)3次。上述培養(yǎng)條件均為黑暗條件，（24±2）℃。

1.2 樣品采集與形態(tài)學(xué)與細(xì)胞學(xué)觀察

體視顯微鏡（Olympus SZX 7）觀察上述C1-C7型愈傷組織的顏色、質(zhì)地、分散程度等外部形態(tài)特征，另取上述愈傷組織樣品，參照黃銹賢等[12]方法制作臨時(shí)切片，將樣品置于載玻片用醋酸洋紅染色1 min，清水沖洗干凈后再用伊文思蘭染色1 min，清水沖凈染液蓋上蓋玻片，光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS BX51）觀察并拍照。液氮速凍上述7種類型愈傷組織后保存于-80 ℃冰箱用于生理指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

參照李勝等[13]的方法，過氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原法，過氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用紫外吸收法，可溶性糖含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，淀粉含量測(cè)定采用蒽酮比色法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2021軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖，SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan新復(fù)極差法（P<0.05）進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型紅松愈傷組織的形態(tài)學(xué)、組織細(xì)胞學(xué)觀察和體胚分化能力評(píng)估

植物體胚發(fā)生中愈傷組織胚性大小的鑒定通常采用形態(tài)學(xué)、組織細(xì)胞學(xué)觀察與體胚分化能力評(píng)估相結(jié)合的方法[11]。本研究將紅松EC（圖1A）繼代到相同組成成分的培養(yǎng)基時(shí)，最初誘導(dǎo)的高胚性的白色愈傷組織外部形態(tài)發(fā)生了顯著的變化。繼代2個(gè)月的愈傷組織（C1）呈白色半透明狀，質(zhì)地疏松帶有黏性，愈傷表面有少量絲狀物，愈傷組織活性強(qiáng)（圖1B）。C2型愈傷組織（圖1C）為繼代6個(gè)月的愈傷組織，乳白色不透明，質(zhì)地松散，幾乎不具粘性，表面沒有絲狀物，與C1型相比，C2型增殖速度稍慢。C3型愈傷組織（圖1D）呈淡黃色不透明狀，質(zhì)地疏松不具粘性，表面無絲狀物，但其增殖速度特別快，在1個(gè)培養(yǎng)周期（2周）體積增加3～4倍。水漬型愈傷組織（C4）呈乳白色，質(zhì)地呈致密的水漬狀，略帶粘性（圖1E），這種類型的愈傷組織在多次繼代后不再持續(xù)保持增殖。纖維化的愈傷組織（C5）近白色雪花狀，質(zhì)地松散，表面纖維化，不具粘性，隨著繼代次數(shù)的增加，纖維化程度越加嚴(yán)重（圖1F）。褐化的愈傷組織（C6）呈不透明狀，愈傷表面可見多個(gè)褐色斑點(diǎn)（圖1G），隨著后續(xù)繼代次數(shù)的增加愈傷組織褐化日益加重，最終細(xì)胞完全失去活性。此外，體胚分化處理7 d后，其他類型的愈傷組織（C2—C6）均未見有球形胚的分化，僅在C1型愈傷組織表面觀察到有分化的球形胚出現(xiàn)（C7），由圖1H可見在愈傷表面形成多個(gè)略帶黃色的不透明突起（紅色圓圈），即球形胚。綜上所述，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)不同類型的愈傷組織增殖速度差異較大，其中黃色的愈傷組織增殖速度最快，褐化和水漬型愈傷組織不發(fā)生增殖或增殖速度較慢，纖維化及2種不同胚性的白色愈傷組織增殖速度居中。

顯微觀察發(fā)現(xiàn)C1型愈傷細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的極性化，含不同發(fā)育階段的原胚團(tuán)（proembryogenic masses， PEMs）結(jié)構(gòu)，如含圓形胚頭（EH， embryonal heads）和長(zhǎng)條形空泡化的胚柄（S， suspensor）組成的PEMⅠ結(jié)構(gòu)（圖2A），以及由多個(gè)EH和數(shù)條S組成的PEM Ⅱ結(jié)構(gòu)（圖2B）。而在C2型愈傷組織細(xì)胞中PEMs出現(xiàn)解體，EH與S出現(xiàn)分離（圖2C）；C3—C5型愈傷組織中出現(xiàn)大量的不規(guī)則形狀細(xì)胞，如長(zhǎng)條形、圓形或橢圓形、棒狀等（圖2D—F）。同時(shí)，在C6型愈傷組織中雖可見到PEMs結(jié)構(gòu)，但PEMs中的EH出現(xiàn)明顯的降解，也見到少數(shù)類似C2型愈傷中由PEMs結(jié)構(gòu)解體下來的EH和S（圖2G）。此外，C7型愈傷與C1型相比球形胚中細(xì)胞團(tuán)體積更大，聚集的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量更多、結(jié)構(gòu)更為緊湊，同時(shí)也見到長(zhǎng)條形的液泡化S細(xì)胞出現(xiàn)降解（圖2H）。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果得出，繼代2個(gè)月的紅松愈傷組織（C1）具有更高的胚胎發(fā)生潛力，其他類型的愈傷組織（C2-C6）的胚胎發(fā)生能力顯著降低，甚至在繼代培養(yǎng)6個(gè)月后幾乎失去了胚性能力。

2.2 不同類型紅松愈傷組織抗氧化酶（POD、SOD、CAT）活性變化

不同類型愈傷組織POD活性差異明顯，C1和C6型愈傷組織中POD活性最高，分別為101.11和95.56 U·mg-1，且顯著高于其他幾種類型的愈傷組織（P<0.05），分別是活性最弱的C4、C7的2.6和2.4倍（圖3A），說明紅松保持高胚性的EC存在高水平的POD活性，但高POD活性不是紅松高胚性的愈傷組織獨(dú)有的標(biāo)志，這也一定程度上反映紅松EC維持高胚性這個(gè)事件不是單一酶類在起作用，需要多種酶類協(xié)同調(diào)控。

SOD活性測(cè)定結(jié)果表明，C3型愈傷組織中SOD活性最高（307.83 U·g-1），除與C2型愈傷組織（259.47 U·g-1）差異不顯著（P<0.05）外，顯著高于其他5種類型的愈傷組織，分別為活性最弱的C1、C7的3.3倍和3.5倍（圖3B），由此推測(cè)，紅松EC繼代過程中胚性的維持和體胚分化可能需要低水平的SOD活性，SOD活性高會(huì)促使增殖速度最快的黃色愈傷組織形成。

與SOD、POD變化趨勢(shì)不同，C2與C7具有高的CAT活性，分別為14.49和14.14 U·g-1，二者之間差異不顯著，但顯著高于其他5種類型愈傷組織的CAT活性（P<0.05），是活性最弱的C6的3.8～3.9倍（圖3C）。上述結(jié)果說明高水平的CAT活性有利于紅松EC體胚分化的啟動(dòng)和低胚性的白色愈傷組織的形成。

2.3 不同類型紅松愈傷組織貯藏類物質(zhì)（可溶性糖、淀粉）含量的變化

C1型愈傷組織中可溶性糖含量最高（24.66 mg·g-1），顯著高于其他類型的愈傷組織（P<0.05），其他類型愈傷組織間差異不顯著（圖3D）。與可溶性糖含量變化趨勢(shì)類似，淀粉含量在高胚性的愈傷組織（C1）中最高（1.13 mg·g-1），顯著高于其他類型愈傷組織（P<0.05）（圖3E）。由此可見，淀粉和可溶性糖這兩大類貯藏物質(zhì)對(duì)于紅松EC維持胚性影響較大。

3 討 論

3.1 長(zhǎng)期繼代獲得的紅松不同類型愈傷組織形態(tài)學(xué)差異分析

對(duì)于間接體胚發(fā)生途徑的針葉樹來說，初代誘導(dǎo)的EC需要定期更換到新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)[5，14]，然而伴隨著EC繼代次數(shù)增加，細(xì)胞活性和體胚分化能力逐漸降低的同時(shí)，褐變和壞死也隨之增加[11，15]。通常情況下，通過觀察愈傷組織外部形態(tài)并根據(jù)其特征評(píng)估胚性能力是最為直接、方便地鑒定其胚性大小的方法[11，16]。本研究將紅松EC進(jìn)行多次繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)最初誘導(dǎo)的白色粘性的EC外部形態(tài)發(fā)生顯著的變化的同時(shí)，體胚分化能力也顯著降低，只有高胚性的愈傷組織（C1）經(jīng)饑餓處理可以分化出球形胚，而其他類型的愈傷組織未見有球形胚的分化。類似地，油橄欖（Olea europaea）[8]、俯竹（Bambusa nutans）[16]、苜蓿（Medicago sativa）[17]、花櫚木（Ormosia henryi）[18]等研究中也發(fā)現(xiàn)EC存在難以長(zhǎng)期保持胚性的問題，長(zhǎng)期繼代會(huì)導(dǎo)致EC逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色、綠色以及褐色的非胚性愈傷組織（non-embryogenic callus，NEC）。眾多研究證實(shí)在針葉樹EC的保持過程中會(huì)依次經(jīng)歷PEMI、PEMII和PEMIII這些以細(xì)胞聚集為特征的發(fā)育階段[8，19-20]，本研究在繼代2個(gè)月的紅松高胚性白色愈傷組織中觀察到PEMs的結(jié)構(gòu)，而在其他5種類型的愈傷組織（C2-C6）中僅觀察到PEMs解體下來的胚頭和胚柄，以及大量形狀不規(guī)則的細(xì)胞和PEMs中發(fā)生降解的細(xì)胞，并且未見有球形胚的分化，上述細(xì)胞與苜蓿[17]、花櫚木[18]中NEC內(nèi)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)類似。上述結(jié)果說明紅松愈傷組織外部形態(tài)、內(nèi)部組織細(xì)胞特征與胚性強(qiáng)弱之間關(guān)系密切，而且繼代培養(yǎng)時(shí)具有PEMs-like的結(jié)構(gòu)將有助于紅松EC保持高胚性，而PEMs結(jié)構(gòu)的解體或消失會(huì)導(dǎo)致胚性的降低或消失。此外，本研究發(fā)現(xiàn)繼代獲得的6種類型的紅松愈傷組織增殖速度差異也較大，并不是所有發(fā)生非胚性化的愈傷組織生長(zhǎng)速度都減慢，如黃色愈傷組織，雖然胚性降低，但是愈傷的增殖速度非?？?，由此推測(cè)紅松EC發(fā)生非胚性化形成不同類型愈傷組織的生理特征可能是不同的。

3.2 抗氧化酶與紅松EC胚性能力的保持及體胚分化啟動(dòng)的關(guān)系

植物從體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞，或者由胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉桥咝约?xì)胞，以及由胚性細(xì)胞啟動(dòng)胚胎分化的過程，均涉及一系列復(fù)雜的生理生化變化[11，21]。離體培養(yǎng)條件下，傷口的刺激會(huì)造成過量ROS的積累，擾亂細(xì)胞內(nèi)原有的氧化還原穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞正常代謝失衡和生理功能喪失。然而，植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的抗氧化系統(tǒng)可以及時(shí)清除過量的ROS，其中SOD、POD和CAT是構(gòu)成抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶[22]。研究表明植物體胚發(fā)生過程與SOD、POD和CAT活性的變化密切相關(guān)[23-27]，本研究得出，紅松EC胚性的保持及體胚分化的啟動(dòng)過程也受細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)的協(xié)同調(diào)控，SOD、POD、CAT這3種關(guān)鍵酶活性在7種不同顏色、質(zhì)地的愈傷組織間存在差異，其中紅松EC維持高胚性需要高POD活性，POD活性高可以使細(xì)胞有利于清除積累氧自由基使ROS重新恢復(fù)動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用，與本研究結(jié)果一致，花櫚木[18]和油橄欖[24]EC中POD活性高于NEC，然而在俯竹[16]、百子蓮（Agapanthus africanus）[25]、楸樹（Catalpa bungei）[26]EC中卻發(fā)現(xiàn)POD活性低于NEC，說明POD活性對(duì)于EC維持胚性的作用可能在不同植物間是存在差異的。此外，在褐化的紅松愈傷組織中POD活性也較高，花櫚木[18]和淫羊藿（Epimedium brevicornu）[27]研究中也得到類似的結(jié)果，分析可能是由于POD酶活性的增強(qiáng)加速了酚類物質(zhì)的催化導(dǎo)致形成褐色的聚合體，因此導(dǎo)致愈傷組織出現(xiàn)褐變。

植物細(xì)胞受ROS和自由基傷害時(shí)會(huì)迅速啟動(dòng)自身調(diào)控機(jī)制，如，細(xì)胞通過SOD活性的增加及時(shí)清除自由基來維持細(xì)胞內(nèi)原有的氧化還原穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而保證細(xì)胞正常進(jìn)行分裂和分化[28-29]。本研究中SOD活性低有利于紅松EC胚性的維持和早期體胚分化的啟動(dòng)，SOD活性高則可促進(jìn)黃色愈傷組織的形成，即胚性愈傷受到的氧化應(yīng)激損傷較小，早期體胚分化階段細(xì)胞的代謝活性較高，因此SOD活性較低；而當(dāng)氧化應(yīng)激損傷較大時(shí)，SOD含量將相應(yīng)提高[30]。與本研究結(jié)果一致，Peng等[2]開展的紅松研究中也發(fā)現(xiàn)NEC中SOD活性高于EC；然而花櫚木研究中卻發(fā)現(xiàn)EC中SOD活性顯著高于NEC和分化的球形胚[18]，百子蓮[25]、杉木（Cunninghamia lanceolata）[31]研究中也得出SOD活性與愈傷組織的成胚能力呈顯著正相關(guān)的結(jié)論，分析這可能是由于不同植物中抗氧化酶系統(tǒng)協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制不同導(dǎo)致的，不同植物中3種關(guān)鍵抗氧化酶SOD、POD、CAT的權(quán)重不同或者氧化應(yīng)激程度存在差異，由此導(dǎo)致SOD活性對(duì)于紅松EC胚性維持與體胚分化的作用與上述百子蓮、花櫚木的研究結(jié)果是相悖的。

除SOD、POD外，CAT在植物調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)中也起著重要作用，長(zhǎng)期繼代細(xì)胞中ROS代謝的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致H2O2含量不斷地升高，而CAT可以通過將H2O2分解為H2O和O2，減少細(xì)胞膜受到損害，進(jìn)而參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化的調(diào)控[32]。本研究中有球形胚分化的紅松愈傷組織中CAT活性最高，類似地，花櫚木[18]體胚發(fā)育早期CAT活性也較高，說明紅松EC啟動(dòng)體胚分化的形態(tài)建成過程存在更多的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而CAT在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)過程中作用顯著。此外，CAT活性在繼代6個(gè)月的白色愈傷組織中也較高，說明與POD、SOD類似，僅是通過CAT活性的高低是不能判斷出愈傷組織胚性潛力大小的，同時(shí)單一酶活性高低也不能作為體胚啟動(dòng)分化的標(biāo)志物，紅松EC維持高胚性和體胚分化啟動(dòng)事件需要多種酶類的協(xié)同調(diào)控。

3.3 貯藏類物質(zhì)與紅松胚性能力的保持及體胚分化的關(guān)系

除酶活性外，可溶性糖和淀粉含量的變化常用于揭示植物體胚發(fā)生中胚性能力的獲得與保持、體胚分化的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制。淀粉是重要的能量貯存物質(zhì)，其分布、積累和消耗與細(xì)胞分裂、分化相關(guān)聯(lián)[33-34]，糖類是植物胚胎發(fā)育過程不可或缺的能量物質(zhì)和碳骨架，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，決定細(xì)胞的形態(tài)和發(fā)育命運(yùn)[23]。與花櫚木[18]和香樟（Camphora officinarum）[35]的研究結(jié)果一致，本研究中在紅松高胚性的愈傷組織中可溶性糖、淀粉含量均較高，這說明可溶性糖、淀粉這兩大類貯藏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過為紅松胚性細(xì)胞直接供能，以保持細(xì)胞的活性及胚胎的形態(tài)分化潛力。

4 結(jié) 論

綜上，長(zhǎng)期繼代的紅松EC維持高胚性需要充足的貯藏類物質(zhì)作為儲(chǔ)備能量，同時(shí)適宜強(qiáng)度的保護(hù)酶對(duì)紅松EC維持高胚性及啟動(dòng)體胚分化具有促進(jìn)作用，酶活性強(qiáng)度不適宜會(huì)致使紅松愈傷組織顏色、質(zhì)地，以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)等基本性狀發(fā)生改變的同時(shí)，導(dǎo)致EC保持高胚性潛力以及啟動(dòng)體胚分化的命運(yùn)發(fā)生改變。值得注意的是不同類型紅松愈傷組織形成中起關(guān)鍵作用的酶類不同，3種抗氧化酶活性均較低時(shí)，易于形成水漬型和纖維化的愈傷組織。POD活性高利于EC維持PEMs結(jié)構(gòu)進(jìn)而保持高胚性，但POD活性過高也會(huì)導(dǎo)致PEMs結(jié)構(gòu)的降解引起愈傷組織發(fā)生褐變；CAT活性高促進(jìn)球形胚的形成，PEMs結(jié)構(gòu)解體會(huì)導(dǎo)致形成低胚性的白色愈傷組織；SOD活性高利于黃色愈傷組織的形成，SOD活性低則利于紅松EC胚性的維持和早期體胚分化的啟動(dòng)。由于紅松EC胚性能力的保持與體胚分化過程是一個(gè)復(fù)雜的發(fā)育過程，該過程受基因表達(dá)、代謝水平、生理生化等多種因素影響，因此后續(xù)還需要對(duì)其分子機(jī)制開展系統(tǒng)深入的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] WANG L， LI X Y， WANG H C. Physicochemical properties， bioaccessibility and antioxidant activity of the polyphenols from pine cones of Pinus koraiensis[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2019，126：385-391.

[2] PENG C X， GAO F， WANG H， et al. Physiological and biochemical traits in Korean pine somatic embryogenesis[J]. Forests， 2020，11（5）：577.

[3] NIE S， YAN Y， WANG Y， et al. Proper doses of brassinolide enhance somatic embryogenesis in different competent Korean pine cell lines during embryogenic callus differentiation[J]. Frontiers in Plant Science，2024，15：1330103.

[4] 李建安，韓志強(qiáng).經(jīng)濟(jì)林遺傳改良與品種創(chuàng)制研究進(jìn)展[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2023，41（1）：1-13. LI J A， HAN Z Q. Advances in genetic improvement and variety innovation of non-wood forest[J]. Non-wood Forest Research，2023，41（1）：1-13.

[5] LIANG Y， XU X， SHEN H L， et al. Morphological and endogenous phytohormone changes during long-term embryogenic cultures in Korean pine[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture，2022，151（2）：253-264.

[6] EGERTSDOTTER U， AHMAD I， CLAPHAM D. Automation and scale up of somatic embryogenesis for commercial plant production， with emphasis on conifers[J]. Frontiers in Plant Science， 2019，10：109.

[7] NASCIMENTO A M， BARROSO P A， NASCIMENTO N F， et al. Pinus spp. somatic embryo conversion under high temperature： effect on the morphological and physiological characteristics of plantlets[J]. Forests，2020，11（11）：1181.

[8] FILONOVA L H， BOZHKOV P V， VON ARNOLD S. Developmental pathway of somatic embryogenesis in Picea abies as revealed by time-lapse tracking[J]. Journal of Experimental Botany， 2000，51（343）：249-264.

[9] GAO F， PENG C X， WANG H， et al. Selection of culture conditions for callus induction and proliferation by somatic embryogenesis of Pinus koraiensis[J]. Journal of Forestry Research， 2021，32（2）：483-491.

[10] PIRES R， CARDOSO H， RIBEIRO A， et al. Somatic embryogenesis from mature embryos of Olea europaea cv.‘Galega Vulgar’ and long-term management of calli morphogenic capacity[J]. Plants，2020，9（6）：758.

[11] PASSAMANI L Z， REIS R S， VALE E M， et al. Long-term culture with 2，4-dichlorophenoxyacetic acid affects embryogenic competence in sugarcane callus via changes in starch， polyamine and protein profiles[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2020，140（2）：415-429.

[12] 黃銹賢，郭松，賈冬冬，等.麻竹主枝扦插生根過程及其生理生化變化[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2023，41（4）：245-253. HUANG X X， GUO S， JIA D D， et al. Study on the rooting process and physiological and biochemical changes of main branch cuttings of Phyllostachys macrophylla[J]. Non-wood Forest Research，2023，41（4）：245-253.

[13] 李勝，馬紹英.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].2版.北京：高等教育出版社，2022.LI S， MA S Y. Plant physiology experiments[M]. 2nd ed. Beijing： Higher Education Press，2022.

[14] LI Q F， DENG C， ZHU T Q， et al. Dynamics of physiological and miRNA changes after long-term proliferation in somatic embryogenesis of Picea balfouriana[J]. Trees，2019，33（2）：469-480.

[15] BRADA？ F， PLIEGO-ALFARO F， SáNCHEZ-ROMERO C. Long-term somatic embryogenesis in olive （Olea europaea）： Influence on regeneration capability and quality of regenerated plants[J]. Scientia Horticulturae，2016，199：23-31.

[16] RAJPUT D S， RATHORE T S， ANSARI S A， et al. Biochemical changes in embryogenic and non-embryogenic callus of Bambusa nutans during somatic embryogenesis[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture，2023，155：127-135.

[17] KPCZY？SKA E， OROWSKA A. Profiles of endogenous ABA， bioactive GAs， IAA and their metabolites in Medicago truncatula Gaertn. non-embryogenic and embryogenic tissues during induction phase in relation to somatic embryo formation[J]. Planta，2021，253（3）：67.

[18] WU G Y， WEI X L， WANG X， et al. Changes in biochemistry and histochemical characteristics during somatic embryogenesis in Ormosia henryi Prain[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2020，144（3）：505-517.

[19] ZHOU X H， ZHENG R H， LIU G X， et al. Desiccation treatment and endogenous IAA levels are key factors influencing high frequency somatic embryogenesis in Cunninghamia lanceolata[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：2054.

[20] PEREIRA-DIAS F， STEINER N， CANGAHAULA-INOCENTE G， et al. Integrated proteomics and histochemical analysis of Araucaria angustifolia （Araucariaceae） in embryogenic suspension culture[J]. Annals of Forest Research，2021，63（2）： 27-43.

[21] QI S Z， ZHAO R R， YAN J C， et al. Global transcriptome and coexpression network analyses reveal new insights into somatic embryogenesis in hybrid sweetgum （Liquidambar styraciflua×Liquidambar formosana）[J]. Frontiers in Plant Science，2021，12：751866.

[22] MANIVANNAN A， JANA S， SOUNDARARAJAN P， et al. Antioxidant enzymes metabolism and cellular differentiation during the developmental stages of somatic embryogenesis in Torilis japonica[J]. Plant Omics，2015，8（5）：461-471.

[23] BARTOS P M C， GOMES H T， AMARAL L I V， et al. Biochemical events during somatic embryogenesis in Coffea arabica[J]. 3 Biotech，2018，8（4）：209.

[24] OULBI S， KOHAICH K， BAAZIZ M， et al. Peroxidase enzyme fractions as markers of somatic embryogenesis capacities in olive（Olea europaea）[J]. Plants，2021，10（5）：901.

[25] 任寧，鄒夢(mèng)雯，陳冠群，等.不同成胚能力的百子蓮愈傷組織中氧化還原水平的差異分析[J].分子植物育種，2022， 20（4）：1281-1288. REN N， ZOU M F， CHEN G Q， et al. Differential analysis of redox levels in callus of Cinnamomum sinensis with different embryo formation ability[J]. Molecular Plant Breeding， 2022，20（4）：1281-1288.

[26] 董靜，段秋笛，徐艷紅，等.長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)過程中楸樹愈傷組織的分化能力[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2024，33（2）：373-379. DONG J， DUAN Q D， YU Y H， et al. Study on the differentiation ability of Catalpa bungei callus during long term subculture[J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica， 2024，33（2）：373-379.

[27] 王笛，裴莉昕，紀(jì)寶玉，等.箭葉淫羊藿愈傷組織的最適誘導(dǎo)條件及其褐化原因[J/OL].分子植物育種，（2023-02-17）[2023-11-29]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S. 20230216.1055.008.html. WANG D， PEI L X， JI B Y， et al. Optimal induction conditions and causes of callus of Epimedium arrowleaf and its causes of browning[J/OL]. Molecular Plant Breeding，（2023-02-17）[2023-11-29]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S. 20230216.1055.008.html.

[28] ALSCHER R G， ERTURK N， HEATH L S. Role of superoxide dismutases （SODs） in controlling oxidative stress in plants[J]. Journal of Experimental Botany，2002，53（372）：1331-41.

[29] IGHODARO O M， AKINLOYE O A. First line defense antioxidants superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT） and glutathione peroxidase （GPX）： their fundamental role in the entire antioxidant defense grid[J]. Alexandria Journal of Medicine， 2018，54：287-293.

[30] 賈冬冬，李在留，鄭云麗，等.毛竹種子發(fā)育過程中形態(tài)和生理特性變化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2024，44（1）：79-88. JIA D D， LI Z L， ZHENG Y L， et al. Changes of morphological and physiological characteristics of Phedulis during seed development[J]. Journal of Central South University of Forestry Technology，2024，44（1）：79-88.

[31] LI Y P， HU R Y， SUN Y H， et al. De novo sequencing and transcriptome analysis reveal genes’ specific expression in Chinese fir （Cunninghamia lanceolata） callus[J]. Forests， 2023，14：993.

[32] BAHMANKAR M， MORTAZAVIAN S M， TOHIDFAR M， et al. Chemical compositions， somatic embryogenesis， and somaclonl variation in cumin[J]. BioMed Research International， 2017，2017：1-15.

[33] AGUILAR-HERNáNDEZ V， LOYOLA-VARGAS V M. Advanced proteomic approaches to elucidate somatic embryogenesis[J]. Frontiers in Plant Science，2018，9：1658.

[34] 岳建華，魏真，董艷，等.碳源對(duì)早花百子蓮愈傷組織誘導(dǎo)及其增殖的生理特性影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2021，41（3）： 439-449. YUE J H， WEI Z， DONG Y， et al. Effect of carbon source on callus induction and proliferation of Lotus earlyiflora[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2021，41（3）：439-449.

[35] 荊茹月，霍坤，李志輝.香樟胚性與非胚性愈傷組織間的差異研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（10）：70-78. JING Y R， HUO K， LI Z H. Differences between embryogenic and non-embryogenic callus tissues of camphora tree[J]. Journal of Central South University of Forestry Technology， 2020，40（10）：70-78.

[本文編校：吳 毅]