摘 要：以腐敗椰果罐頭為試材，選用4種培養(yǎng)基分離純化腐敗椰果罐頭中的細菌，擴增細菌16S rDNA，對16S rDNA序列進行同源比對，并構建系統(tǒng)進化樹，鑒定細菌種屬。結果顯示，從腐敗椰果罐頭中分離得到38株分離菌，經(jīng)16S rDNA分子生物學方法鑒定為Paenibacillus humicus、Staphylococcus warneri、Sphingomonas sp.和Liquorilactobacillus satsumensis。

關鍵詞：腐敗椰果罐頭；16S rDNA；細菌；鑒定

Identification of Microorganisms in Spoiled Coconut Cans by 16S rDNA

SONG Meiling1， GUO Sanbao2， LIAO Li1， WU Qingyang1， HUANG Shenghe1*

（1.Department of Basic Medicine， Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 344000， China; 2.Department of Pharmacy， Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 344000， China）

Abstract： Taking spoiled coconut cans as test material， four kinds of culture media were selected to separate and purify bacteria in spoiled coconut cans， amplify bacterial 16S rDNA， compare the 16S rDNA sequences， construct a phylogenetic tree， and identify the bacterial species. The results showed that 38 isolates were obtained from spoiled coconut cans and identified by 16S rDNA molecular biology method as Paenibacillus humicus， Staphylococcus warneri， Sphingomonas sp.， Liquorilactobacillus satsumensis.

Keywords： spoiled coconut cans; 16S rDNA; bacteria; identification

椰果是醋酸桿菌利用椰子汁發(fā)酵制得的多糖類膠體，顏色微白，呈凝膠半透明狀，具有較好的持水性、韌性和彈性，并富含優(yōu)質(zhì)的膳食纖維，因此被廣泛加工成椰果罐頭。椰果罐頭因爽滑、多汁、脆嫩、細膩而有彈性的獨特口感備受消費者的青睞[1]。

全國有上百家企業(yè)在罐頭生產(chǎn)中出現(xiàn)過組織解體、糊化變質(zhì)、酸敗等質(zhì)量問題[2]。許美玲等[3]通過菌落形態(tài)及生理生化指標，結合BD微生物自動鑒定儀鑒定了腐敗黃桃罐頭中的微生物為團泛菌和地衣芽孢桿菌，腐敗草莓罐頭中的微生物為地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌；史振霞等[4]通過生理生化指標鑒定了腐敗桃罐頭中的微生物主要為凝結芽孢桿菌、黃色絲衣霉、蠟狀芽孢桿菌等。與傳統(tǒng)通過形態(tài)學觀察、生理生化指標鑒定菌種方法相比，16S rDNA分子生物學鑒定方法具有較高的靈敏度，通過比對菌種間16S rDNA可變區(qū)的特異性核苷酸序列，鑒定細菌種屬[5]。16S rDNA分子生物學鑒定方法已被廣泛應用于食品中微生物的鑒定[6-8]，但目前使用該方法鑒定腐敗椰果罐頭中的微生物還鮮有報道。本實驗以保質(zhì)內(nèi)腐敗椰果罐頭為材料，選取4種培養(yǎng)基培養(yǎng)、分離及純化細菌，通過PCR擴增細菌16S rDNA，測序獲得細菌16S rDNA堿基序列，在美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中進行同源序列比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定細菌種屬，以期為優(yōu)化椰果罐頭的殺菌方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

腐敗椰果罐頭樣品由某企業(yè)提供。皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基和酸性肉湯瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術責任有限公司；通用引物、DNA分子量標準Marker，上海生工生物工程有限公司；Taq酶、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR，寶生物工程（大連）有限公司。

雙人單面凈化工作臺，蘇州博萊爾凈化設備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱、智城恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；NanoDrop one超微量分光光度計，賽默飛世爾科技公司；S1000? Thermal Cycler普通PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)，寶誠生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 腐敗椰果罐頭中細菌的分離培養(yǎng)

從相關生產(chǎn)企業(yè)獲得腐敗及密封性良好的椰果罐頭，使用75%酒精對外包裝進行消毒，在超凈工作臺中取200 μL椰果罐頭內(nèi)容物分別涂布于皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基和酸性肉湯瓊脂培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)，倒置連續(xù)培養(yǎng)120 h，每組3個平行實驗，每24 h觀察記錄實驗現(xiàn)象。

1.2.2 腐敗椰果罐頭中細菌的純化培養(yǎng)

觀察菌落形態(tài)，不同形態(tài)菌落應選盡選，相似形態(tài)菌株至少挑選兩株[9]，采用劃線分離法分別接種于相應培養(yǎng)基，進行純化培養(yǎng)。

1.2.3 細菌16S rDNA擴增

使用Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR試劑裂解腐敗椰果罐頭中的細菌，獲得細菌基因組DNA。使用通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R： 5’-GG-TTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR擴增細菌16S rDNA基因序列，PCR均在25 μL標準反應體系中進行，反應體系為10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mix（各2.5 mmol·L-1）2 μL，27F（10 μmol·L-1）、1492R（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA模板1.5 μL，Taq酶（2.5 U·L-1）0.3 μL，滅菌純化水16.7 μL。反應程序為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s、56 ℃復性30 s、72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇結果為陽性的樣品，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.4 16S rDNA序列同源比對及構建系統(tǒng)進化樹

獲得的細菌16S rDNA基因序列在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中，用基本局部比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，Blast）進行同源序列比對，采用鄰接法（Neighbor Joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹，分析并確定腐敗椰果罐頭中細菌的種屬。

2 結果與分析

2.1 腐敗椰果罐頭中細菌分離與純化

腐敗椰果罐頭內(nèi)容物涂布于皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基和酸性肉湯瓊脂培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)120 h，再經(jīng)平板劃線培養(yǎng)獲得38株純化菌株。

2.2 擴增細菌16S rDNA

利用16S rDNA通用引物擴增38株菌株16S rDNA序列，擴增產(chǎn)物大小為1 500 bp左右（圖1），符合預期大小。

2.3 細菌16S rDNA同源序列比對

獲得的細菌16S rDNA序列在NCBI中通過Blast進行同源序列對比，發(fā)現(xiàn)38株菌株屬于4種不同菌，2株菌（A菌）與Paenibacillus humicus（登錄號MT808854.1）相似度99.86%，7株菌（B菌）與Staphylococcus warneri（登錄號MG972924.1）相似度99.86%，1株菌（C菌）與Sphingomonas sp.（登錄號AM900776.1）相似度為100%，28株菌（D菌）與Liquorilactobacillus satsumensis（登錄號KU060283.1）相似度99.86%，詳見表1。

2.4 構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹

系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建結果如圖2所示，A菌與Paenibacillus humicus（登錄號MT808854.1）聚為一支，B菌與Staphylococcus warneri（登錄號MG972924.1）聚為一支，C菌與Sphingomonas sp.（登錄號AM900776.1）聚為一支，D菌與Liquorilactobacillus satsumensis聚為一支（登錄號KU060283.1）。系統(tǒng)發(fā)育樹結果與同源序列比對結果一致，初步推測A菌為Paenibacillus humicus，B菌為Staphylococcus warneri，C菌為Sphingomonas sp.，D菌為Liquorilactobacillus satsumensis。

Staphylococcus warneri為革蘭氏陽性細菌，主要存在于在人體和動物皮膚黏膜表面[10-11]，一般不致病，但該菌可通過靜脈注射等方法進入人體，引發(fā)多種疾病[12]。目前，在牦牛乳[13]、發(fā)病盔形溞[11]、發(fā)病羅非魚苗[12]等中分離鑒定出了該菌，也有文獻報道該菌還存在于發(fā)酵食品中，可發(fā)酵蔗糖和乳糖產(chǎn)酸[14]，導致食品變酸腐敗。

Sphingomonas sp.為革蘭氏陰性細菌，主要存在于常見于土壤和水生環(huán)境中，具有較強的生命力[15]，能夠降解芳香族化合物、重金屬等物質(zhì)，在環(huán)境修復方面具有極高的應用價值[16]。Sphingomonas sp.在生長過程中可分泌鞘氨醇膠，其中的威蘭膠無毒無害，具有較好的持水性，可長期保持果汁飲品中果肉的口感，還可延長果汁飲品的保質(zhì)期。另外，威蘭膠具有良好的增稠效果，且不易受pH值的影響，可作為添加劑添加于果凍、飲料、酸奶及果醬中[17]。Sphingomonas sp.還會產(chǎn)生瓊膠酶，該酶可高效降解瓊膠生成瓊膠寡糖，瓊膠寡糖因具有防腐功能，被廣泛地應用于食品醫(yī)藥領域[18]。

Liquorilactobacillus satsumensis為乳酸菌，在生長過程中利用糖類產(chǎn)生乳酸。有文獻報道，與部分乳酸菌相比，其發(fā)酵速度和產(chǎn)酸能力較弱，但其產(chǎn)生的發(fā)酵液酸度適中，在適宜消費者乳酸菌飲料酸度范圍，是較好的果蔬類發(fā)酵微生物之一[19]。目前，鮮見對Paenibacillus humicus的研究。

3 結論

本文選用4種固體培養(yǎng)基對腐敗椰果罐頭中的細菌進行分離，得到38株細菌，經(jīng)16S rDNA分子生物學方法鑒定為4種菌，分別為Phingomonas sp.、Liquorilactobacillus satsumensis、Staphylococcus warneri和Paenibacillus humicus。推測Sphingomonas sp.和Liquorilactobacillus satsumensis是企業(yè)為保持產(chǎn)品較好口感以及適宜酸度，在椰果罐頭中添加的兩種菌；一線生產(chǎn)人員參與產(chǎn)品從原料到封口滅菌的生產(chǎn)過程，而人體皮膚黏膜表面存在Staphylococcus warneri，推測Staphylococcus warneri來自生產(chǎn)人員；Paenibacillus humicus的來源還需進一步研究。

參考文獻

[1]馬霞，王瑞明，關鳳梅，等.細菌纖維素在食品工業(yè)中的應用[J].中國食物與營養(yǎng)，2002（3）：18-19.

[2]蘇征，高瑞剛，許美玲，等.組織解體黃桃罐頭霉菌的生物學特性及控制技術研究[J].中國口岸科學技術，2023，5（1）：82-87.

[3]許美玲，張鑫，楊娟，等.糖水水果罐頭中主要腐敗微生物的分離純化及鑒定研究[J].食品研究與開發(fā)，2013，34（23）：107-110.

[4]史振霞，杜洪利，歐旭，等.桃罐頭中腐敗微生物的分離純化及鑒定研究[J].食品科學，2009，30（21）：278-282.

[5]劉爽爽，帖云，齊林，等.16S rRNA基因可變區(qū)與全長序列進化關系相似性分析[J].鄭州大學學報（理學版），2022，54（1）：19-24.

[6]吳怡，劉露露，吳永民，等.高通量測序檢測米線中的食源性致病菌[J].食品科學，2022，43（6）：347-352.

[7]張雅靖，舒相華，黃鑫，等.應用16S rDNA分析撒壩火腿表面和內(nèi)部微生物多樣性[J].肉類研究，2020，34（10）：26-32.

[8]劉巧，羅強，張明，等.利用16S rDNA分析不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜的細菌多樣性[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2020，46（22）：91-97.

[9]李雪，鄭曉衛(wèi)，唐璐，等.真空包裝鮮食玉米酸敗微生物分離鑒定及其特性研究[J].食品科技，2023，48（12）：290-298.

[10]丁雨涵，楊江華.沃氏葡萄球菌致人工瓣膜心內(nèi)膜炎1例[J].牡丹江醫(yī)學院學報，2023，44（1）：121-123.

[11]曹雅芹，戚惠穎，徐大勇，等.發(fā)病盔形溞沃氏葡萄球菌的分離與鑒定[J].淡水漁業(yè)，2022，52（5）：46-52.

[12]李曉陀，陳秦，廖承紅，等.發(fā)病羅非魚苗沃氏葡萄球菌的分離與鑒定[J].熱帶生物學報，2013，4（1）：7-10.

[13]魏超，毛建霏，代曉航，等.牦牛乳中沃氏葡萄球菌的分離鑒定與耐藥性分析[J].乳業(yè)科學與技術，2017，40（4）：11-14.

[14]吳海文.新疆番茄醬中幾種主要微生物的分離及生理生化特性研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學，2007.

[15]張穎，楊悅，韋慶慧，等.鞘氨醇單胞菌的特性及應用研究進展[J].化學與生物工程，2021，38（3）：6-13.

[16]劉輝，韋璐璐，朱龍發(fā)，等.鞘氨醇單胞菌的研究進展[J].微生物學通報，2023，50（6）：2738-2752.

[17]錢錦.鞘氨醇單胞菌中威蘭膠裂解酶的初步研究[D].上海：華東理工大學，2021.

[18]錢洗謙，喬樂克，張洪鋒，等.海洋細菌Sphingomonas sp. Q2產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵條件優(yōu)化、酶學性質(zhì)及降解產(chǎn)物研究[J].食品工業(yè)科技，2023，44（18）：139-146.

[19]劉蕓，曹宜，阮傳清.水開菲爾粒中乳酸菌的分離及其發(fā)酵荔枝汁的特性分析[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2023，54（2）：13-21.

基金項目：江西省撫州市社會發(fā)展指導性科技計劃項目（撫科社字〔2023〕7號序列號3）。

作者簡介：宋美玲（1989—），女，江西撫州人，碩士，講師。研究方向：生物化學與分子生物學。

通信作者：黃勝和（1977—），男，江西撫州人，博士，教授。研究方向：生物化學與分子生物學。E-mail： hsh712@163.com。