【摘 要】多重單細(xì)胞蛋白組技術(shù)已成為生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，其中質(zhì)譜流式成像（imaging mass cytometry，IMC）徹底解決了熒光基團(tuán)間嚴(yán)重的串色問題，并彌補(bǔ)了單細(xì)胞測序技術(shù)缺失的組織空間信息。該技術(shù)能夠在單張組織切片上同時(shí)標(biāo)記數(shù)十種靶標(biāo)，并在單細(xì)胞層面獲得它們的表達(dá)水平及細(xì)胞定位，進(jìn)行深度的細(xì)胞表型原位分析并從時(shí)間和空間水平直觀描繪出單細(xì)胞蛋白組圖譜，因其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢逐漸成為腫瘤研究領(lǐng)域新興的強(qiáng)有力工具。本文將詳細(xì)介紹IMC的技術(shù)原理，并通過分析近期應(yīng)用案例闡述其在細(xì)胞表型鑒定、生物標(biāo)志物檢測、腫瘤免疫調(diào)節(jié)判定、腫瘤異質(zhì)性區(qū)分、臨床預(yù)后指導(dǎo)及反應(yīng)預(yù)測等腫瘤研究方面的應(yīng)用進(jìn)展，推動腫瘤空間組學(xué)與現(xiàn)有技術(shù)的進(jìn)一步結(jié)合。

【關(guān)鍵詞】質(zhì)譜流式成像；空間蛋白組；單細(xì)胞分析；腫瘤微環(huán)境；腫瘤標(biāo)志物

【中圖分類號】R73【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【收稿日期】2024-01-15

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號：82172619）；重慶市科衛(wèi)聯(lián)合醫(yī)學(xué)科研資助項(xiàng)目（編號：2024MSXM136）；重慶市沙坪壩區(qū)決策咨詢與管理創(chuàng)新資助項(xiàng)目（編號：2023122）。

Imaging mass cytometry technology and its application in tumor research

Huang Yiwei1，Xiang Tingxiu1，Liu Xinghe2，Ran Jing1，Zhao Yi1

（1.Oncology Laboratory，Chongqing Key Laboratory of Translational Research for Cancer Metastasis and Individualized Treatment，Chongqing University Cancer Hospital；2.School of Medicine，Chongqing University，Chongqing University Cancer Hospital）

【Abstract】Multiplex single-cell proteomics technology has become a hot topic in biomedical research，among which imaging mass cy‐tometry（IMC） completely solves the serious problem of cross-color between fluorophores and makes up for the lack of tissue spatial in‐formation in single-cell sequencing technology. This technique can label dozens of targets simultaneously on a single tissue section，ob‐tain their expression levels and cell localization at the single-cell level，perform in-depth cell phenotypic in situ analysis，and visually depict single-cell proteome maps from the temporal and spatial levels，and due to its unique technical advantages，it has become a pow‐erful tool in the field of tumor research. This article elaborates on the technical principle of IMC and summarizes the advances in the ap‐plication of IMC in cell phenotype identification，biomarker detection，tumor immunomodulatory determination，tumor heterogeneity dif‐ferentiation，clinical prognosis guidance，and response prediction by analyzing recent cases，so as to promote the further integration of tumor spatial omics with existing technologies.

【Key words】imaging mass cytometry；spatial proteome；single-cell analysis；tumor microenvironment；tumor markers

全面探究腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment，TME）是了解腫瘤發(fā)病機(jī)制并探索新治療方案的重要途徑，其中各種類型細(xì)胞不斷相互作用，多種異質(zhì)成分的豐度、定位和功能方向隨著時(shí)間和對治療的反應(yīng)而變化，動態(tài)且復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)影響著腫瘤的病程及其對治療的敏感性。深度挖掘并解析TME的高維信息變得愈發(fā)重要，而諸如scRNA-seq或多光譜熒光成像等高維細(xì)胞分析技術(shù)仍面臨著組織背景丟失，同步可視化的靶標(biāo)數(shù)量有限或方案繁瑣等限制。在空間分辨率下精確分析單細(xì)胞組學(xué)將有助于解讀腫瘤內(nèi)表型信息、異質(zhì)性、細(xì)胞相互作用及分子機(jī)制[1-2]，構(gòu)建TME中重要組份的“空間圖譜”成為一種熱點(diǎn)思路和發(fā)展方向。

目前已有多種技術(shù)被開發(fā)并應(yīng)用于解析腫瘤組織空間數(shù)據(jù)，尤其是細(xì)胞相互作用的原位空間信息[3-4]。其中，質(zhì)譜流式成像（imaging mass cytometry，IMC）在原位免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）基礎(chǔ)上，結(jié)合了質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（CyTOF）和激光消融技術(shù)，能在亞細(xì)胞分辨率下同時(shí)檢測組織樣本中多達(dá)50余種靶標(biāo)的豐度變化及空間分布，極大地提高了繪制TME空間圖譜的潛力[5]，對開展個(gè)性化診療有獨(dú)特優(yōu)勢。近年來，IMC已在腫瘤研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用并不斷擴(kuò)展，一系列研究表明該技術(shù)是破譯腫瘤復(fù)雜性的強(qiáng)大工具。

1 IMC技術(shù)原理

1.1 金屬標(biāo)簽

傳統(tǒng)熒光標(biāo)記成像技術(shù)以熒光基團(tuán)作為標(biāo)簽修飾抗體，標(biāo)記對應(yīng)的標(biāo)志物。不同于此，IMC利用重金屬同位素作為標(biāo)簽修飾抗體，通過檢測同位素豐度，推測在對應(yīng)空間位點(diǎn)上被標(biāo)記的靶標(biāo)物含量[6]。例如，一般約定利用帶有金屬銥（Ir）標(biāo)簽的抗體標(biāo)記細(xì)胞核，定位細(xì)胞或識別單個(gè)細(xì)胞區(qū)域并進(jìn)行分割，再結(jié)合單個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物在不同細(xì)胞中的表達(dá)豐度，可對細(xì)胞進(jìn)行表型分析。為了減少背景信號，通常會避開鈉、鉀、鈣、鐵、鋅等細(xì)胞內(nèi)源性元素，主要選擇過渡金屬、稀土金屬等作為標(biāo)簽金屬。目前已有100余種同位素作為金屬標(biāo)簽成功應(yīng)用于IMC（圖1A），包括成熟的同位素標(biāo)簽釔（Y），銦（In），鑭系元素系列（Pm除外）等，及近年新開發(fā)的106至116 Da鎘系同位素[7]。

利用金屬標(biāo)簽檢測標(biāo)志物一般有3種方式（圖1B）：①大多數(shù)蛋白（或標(biāo)志物）需要通過抗體來結(jié)合金屬標(biāo)簽，標(biāo)記后進(jìn)行檢測；②部分可不經(jīng)過抗體直接與金屬標(biāo)簽結(jié)合，它們可直接進(jìn)行檢測[8]；③可制備帶有金屬標(biāo)簽和熒光基團(tuán)的雙標(biāo)記抗體[9]，某些熒光抗體結(jié)合標(biāo)志物后也可再結(jié)合金屬標(biāo)簽[10]，2種方式都可實(shí)現(xiàn)免疫熒光與進(jìn)一步的質(zhì)譜定量分析。當(dāng)金屬標(biāo)簽與一抗偶聯(lián)信號較弱時(shí)，還可引入帶有金屬標(biāo)記的二抗來放大弱信號。應(yīng)當(dāng)注意，在臨床診斷或治療中可能引入金屬污染，如鉑鹽治療（順鉑、奧沙利鉑等）或使用釓造影劑，從而導(dǎo)致患者樣本存在干擾信號。因此，需要避開污染的元素選擇金屬標(biāo)簽，但也可直接將這些已知的治療性/診斷性金屬視作標(biāo)簽進(jìn)行IMC檢測[11]。此外，利用釕能與細(xì)胞質(zhì)均勻結(jié)合的特性，再與銥染色搭配，可以模擬蘇木精和伊紅染色[12]。

1.2 常規(guī)實(shí)驗(yàn)流程

標(biāo)志物的選擇：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)除了依據(jù)研究目的，還應(yīng)確保標(biāo)志物擁有能穩(wěn)定結(jié)合的抗體，才能進(jìn)行IMC檢測。適用的抗體可使用商業(yè)化產(chǎn)品，也可自主合成，一般以標(biāo)志物能在預(yù)實(shí)驗(yàn)（免疫組化）中獲得良好染色為前提。

抗體設(shè)計(jì)與選擇：金屬標(biāo)簽在數(shù)量和類型上都遠(yuǎn)超過熒光標(biāo)簽，抗體可根據(jù)需要自主搭配可結(jié)合的金屬標(biāo)簽，豐富的選擇性使檢測方案設(shè)計(jì)更加靈活。利用金屬標(biāo)簽抗體標(biāo)記時(shí)，應(yīng)注意保持與預(yù)實(shí)驗(yàn)條件相同，金屬標(biāo)簽與抗體結(jié)合的穩(wěn)定性可能受到抗體孵育pH、時(shí)間、溫度等前處理?xiàng)l件的影響。標(biāo)志物表達(dá)量高低不同，孵育條件的差異直接會影響檢測信號的強(qiáng)弱[13-15]。另外，考慮到金屬偶聯(lián)可能會改變抗體對其表位的親和力[10]，還需通過IMC分析金屬標(biāo)記的性能來優(yōu)化操作方案。

樣本的前處理：IMC檢測可直接選擇常規(guī)石蠟包埋組織（formalin-fixed and paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）切片或冷凍切片作為樣本，但不同于傳統(tǒng)免疫熒光染色，IMC能對單張切片一次性孵育多個(gè)金屬標(biāo)簽抗體完成標(biāo)記。最后以一次高濃度的銥染色結(jié)束，達(dá)到強(qiáng)化細(xì)胞核染色并終止所有免疫反應(yīng)的目的。

上機(jī)操作：上機(jī)前需預(yù)先對感興趣的區(qū)域（region of interest，ROI）進(jìn)行定位，一般而言，預(yù)實(shí)驗(yàn)中完成的免疫組化切片可以幫助定位。若使用商業(yè)化金屬標(biāo)簽抗體，因試劑盒提供了成熟的實(shí)驗(yàn)條件而無需免疫組化步驟，則另需1張組織樣本的連續(xù)切片，通過HE染色輔助ROI定位。對已完成顯微識別的免疫熒光標(biāo)記樣本，也可直接在玻片上選定ROI，再次引入金屬標(biāo)簽并進(jìn)行IMC檢測，但前提是其前期處理方法沒有損害IMC必需的抗體固定和后期質(zhì)譜獲取。上機(jī)檢測時(shí)，激光以固定速率對樣本組織進(jìn)行微米精度的燒蝕消融，并對單位面積內(nèi)的消融產(chǎn)物逐點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析[16-17]。掃描組織位點(diǎn)中的同位素豐度對應(yīng)了原始坐標(biāo)中的標(biāo)志物含量，并以此為依據(jù)整合出空間水平上的多通道多參數(shù)圖像[6]。

數(shù)據(jù)分析：掃描并采集的ROI面積和數(shù)量決定了獲得數(shù)據(jù)所需的分析算力，包括可視化、質(zhì)量控制檢查和大量的預(yù)處理（圖2A）。因此IMC數(shù)據(jù)的分析處理需要使用多種軟件、操作系統(tǒng)和生物信息學(xué)知識，其主要步驟可概括為：①導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)；②完成人工/自動細(xì)胞分割，生成掩碼；③將掩碼導(dǎo)入分析軟件，進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)。目前有多種開源性軟件可供選擇，如，MCDViewer對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行查看或預(yù)處理，Cell Profiler進(jìn)行圖像去噪和細(xì)胞分割，并導(dǎo)出單細(xì)胞數(shù)據(jù)支撐后續(xù)分析[18]。Histocat能以單細(xì)胞分辨率量化所有通道的分割數(shù)據(jù)，并通過熱圖、散點(diǎn)圖、降維分析[T分布和隨機(jī)近鄰嵌入（T-distributed stochastic neighbor embedding，T-SNE）；主成分分析（principal components analysis，PCA）]和其他聚類工具進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化，識別細(xì)胞表型和定量，鄰域分析以及細(xì)胞空間相互作用[19]。也有團(tuán)隊(duì)總結(jié)并提供了一套可供參考的通用操作方法Github（https：//bodenmillergroup. github.io/ IMCDataAnalysis/）。

2 IMC在腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用

IMC技術(shù)的主要優(yōu)勢體現(xiàn)對樣本空間信息的解析，以及檢測廣度、精度和深度的提升。金屬標(biāo)簽的使用帶來了優(yōu)秀的多通道標(biāo)記能力，使得研究者能在單次實(shí)驗(yàn)中同步獲取大量靶標(biāo)的全景信息，而不必通過多次重復(fù)細(xì)胞流式或免疫組化來綜合（圖2B）。相較于病理醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)性判讀，質(zhì)譜儀精準(zhǔn)地量化了生物標(biāo)志物的表達(dá)，有助于疾病分類與分級，高精度的多靶標(biāo)數(shù)據(jù)也成為了腫瘤細(xì)胞表型研究的主要依據(jù)，對重新定義細(xì)胞亞群特征和TME成分有重要作用。近期一系列研究應(yīng)用IMC表征腫瘤患者或樣本間的生物學(xué)差異，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)的患者分層和預(yù)后。同時(shí)，結(jié)合檢測標(biāo)志物對應(yīng)的空間微觀信息，研究者能跟蹤和定位不同細(xì)胞亞群并分析其相互作用，識別細(xì)胞表型差異及演進(jìn)過程，進(jìn)而解析腫瘤免疫微環(huán)境（immune tumor microenviron‐ment，iTME）和腫瘤異質(zhì)性。

2.1 細(xì)胞表型

大多數(shù)臨床診療依賴于腫瘤亞型的組織病理學(xué)分層，而單細(xì)胞表型的精準(zhǔn)分析對鑒定和定義亞型至關(guān)重要。近期有團(tuán)隊(duì)利用IMC對352例乳腺癌樣本進(jìn)行了35個(gè)抗體指標(biāo)的檢測，分析細(xì)胞表型和相互作用鑒定出23個(gè)細(xì)胞亞群，并重新定義18個(gè)與不同臨床結(jié)果相關(guān)的新亞群。鑒于乳腺癌臨床診斷?；趯υl(fā)腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分析，所以作者還通過比對205例原發(fā)性乳腺癌及匹配的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移單細(xì)胞表型，觀察到轉(zhuǎn)移部位存在彌散性細(xì)胞表型，其與原發(fā)部位表型差異明顯，且經(jīng)常偏離臨床疾病亞型，據(jù)此確定與患者生存相關(guān)彌散性腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞表型和空間組織特征，并指出表征彌散性腫瘤細(xì)胞的分子信息用于乳腺癌臨床預(yù)后的價(jià)值尚未開發(fā)[20-21]。在構(gòu)建的胰腺癌肝轉(zhuǎn)移（pancre‐atic cancer with liver metastasis，PCLM）小鼠模型中，研究者利用單細(xì)胞RNA-seq從正常肝臟和治療前后PCLM樣本的免疫細(xì)胞集群中鑒定出12個(gè)亞群后，進(jìn)一步結(jié)合IMC表征其空間分布，從解析的iTME中發(fā)現(xiàn)了激活的iNKT細(xì)胞（invariant natural killer T cells）通過調(diào)節(jié)NK細(xì)胞，T細(xì)胞及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對PCLM起重要保護(hù)作用[22]。

除了用于定義功能亞群，空間信息的表征還使細(xì)胞表型分析反映出不同亞群間的空間關(guān)系及相互作用。例如，有研究借助CyTOF檢測細(xì)胞懸液樣本生成了全血免疫組，并結(jié)合RNA-seq、免疫組化和IMC數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析，表征了化膿性汗腺炎患者皮膚病變的空間免疫圖譜，發(fā)現(xiàn)在病變皮膚中CD38+經(jīng)典型單核細(xì)胞及其衍生的巨噬細(xì)胞量尤為豐富，提出靶向CD38在臨床試驗(yàn)中的價(jià)值[23]。腫瘤長期作為獨(dú)立實(shí)體被研究而忽略了局部微環(huán)境的作用，空間信息使研究者能夠破譯原位生態(tài)系統(tǒng)。有團(tuán)隊(duì)采用IMC研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤的空間蛋白質(zhì)組學(xué)，輔助發(fā)現(xiàn)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）基本特征，并闡述了局部區(qū)域中腫瘤-宿主的相互依存關(guān)系，為探索其復(fù)發(fā)和治療抗性提供支撐[24]。

2.2 腫瘤標(biāo)志物

目前臨床腫瘤標(biāo)志物的來源、種類和檢測方法都已多種多樣，相較于開發(fā)新標(biāo)志物，IMC更有助于對現(xiàn)有標(biāo)志物進(jìn)行精細(xì)分類，指標(biāo)分級或組合聯(lián)用，被認(rèn)為是多模式生物標(biāo)志物開發(fā)的重要渠道，有助于進(jìn)一步優(yōu)化并提升臨床實(shí)用價(jià)值[25]。慢性組織細(xì)胞間絨毛炎（chronic histiocytic intervillosi‐tis，CHI）是胎盤中罕見的組織病理特征，由于能從少量樣本中挖掘出豐富的信息，當(dāng)利用IMC對CHI胎盤和匹配（雙胞胎）對照的組織切片樣本進(jìn)行深度可視化后，研究者在絨毛間隙中發(fā)現(xiàn)了5種不同表型的CD68+細(xì)胞群，且其中3種是CHI明顯存在并獨(dú)有的，空間共定位將它們與鄰近細(xì)胞的免疫抑制酶CD39表達(dá)降低建立起關(guān)聯(lián)，這些特異性細(xì)胞亞群的鑒定有望成為疾病診斷的標(biāo)志物[26]。借助多通道標(biāo)記能力，有團(tuán)隊(duì)對來自不同炎性疾病的結(jié)直腸和胃腫瘤組織進(jìn)行了39項(xiàng)標(biāo)志物綜合分析，發(fā)現(xiàn)了腫瘤組織與周圍淋巴之間多層次的密切相互作用，僅以CD20、CD21和CD23 3個(gè)標(biāo)志物的組合特征實(shí)現(xiàn)對三級淋巴組織進(jìn)行精細(xì)分類，進(jìn)而輔助區(qū)分不同疾病，新的分類標(biāo)準(zhǔn)對這些疾病的診斷、預(yù)警和預(yù)后都極具價(jià)值[27]。

通過在空間分辨率下剖析腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，能識別并追蹤蛋白和免疫學(xué)信號在不同發(fā)展階段的演進(jìn)。有研究聯(lián)合靶向空間組學(xué)和單細(xì)胞RNA-seq分析結(jié)直腸癌樣本，檢測到巨噬細(xì)胞亞群從促炎功能轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咭种票硇?，提供了從正常組織逐步進(jìn)展到結(jié)直腸癌期間巨噬細(xì)胞群發(fā)生變化的證據(jù)，確定了與疾病進(jìn)展密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，以及可在臨床中利用的靶向免疫過程[28]。在空間背景下識別由微環(huán)境變化導(dǎo)致的多種轉(zhuǎn)錄自調(diào)控，幫助構(gòu)建了GBM與其局部微環(huán)境相互作用的圖譜，也為診療早期GBM提供可能的標(biāo)志物靶點(diǎn)[24]。此外，對TME變化的解析還能幫助研究者識別藥物或治療手段的效能。最近研究利用IMC表征了非小細(xì)胞肺癌對免疫治療反應(yīng)的免疫微環(huán)境，證明了CXCL13的表達(dá)與患者的免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune check‐point inhibitors，ICI）療效相關(guān)，且重組CXCL13增強(qiáng)了體內(nèi)抗PD-1反應(yīng)，增加了T細(xì)胞亞群并減少了CCR2+單核細(xì)胞[29]。通過IMC繪制三陰性乳腺癌原位中的多細(xì)胞腫瘤生態(tài)系統(tǒng)圖，研究人員還發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵的免疫檢查點(diǎn)阻斷反應(yīng)預(yù)測因素[30]。這些特征與腫瘤臨床數(shù)據(jù)結(jié)合，有望發(fā)現(xiàn)能預(yù)測患者對ICI反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物，還可以提高理解iTME在ICI反應(yīng)中起到的作用。研究者還能利用IMC同步分析微環(huán)境中的胞外蛋白、核酸等生物成分，以腫瘤進(jìn)展中因細(xì)胞異?；蛩拗魇苣[瘤刺激產(chǎn)生的一系列物質(zhì)，來定義TME特征或靶向免疫過程，探索有臨床意義的標(biāo)志物組合[31-33]。這些研究進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了利用空間分析揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展中分子和免疫學(xué)景觀的必要性，有助于繪制腫瘤進(jìn)展過程中持續(xù)失調(diào)的基因、通路和TME，并識別臨床相關(guān)的生物標(biāo)志物。

2.3 腫瘤免疫

越來越多的證據(jù)表明，空間組織上的免疫生態(tài)對于理解腫瘤免疫機(jī)制至關(guān)重要，了解iTME與腫瘤生物學(xué)的相關(guān)性，以及利用特定免疫細(xì)胞亞群來改善預(yù)后的可能性，對優(yōu)化免疫治療具有開發(fā)和轉(zhuǎn)化價(jià)值。有團(tuán)隊(duì)利用IMC對139例高級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤和46例腦轉(zhuǎn)移瘤的免疫微環(huán)境進(jìn)行表征，得到腦部TME的高維空間圖，通過對比原發(fā)性腦腫瘤和源自不同實(shí)體瘤的腦轉(zhuǎn)移瘤之間的免疫微環(huán)境，確定了一種與長期生存相關(guān)的獨(dú)特中性粒細(xì)胞樣巨噬細(xì)胞亞群（髓過氧化物酶陽性）[34]。將GBM的空間特征與患者生存率相關(guān)聯(lián)，提示了在特定TME中對巨噬細(xì)胞采用特定特征編程可能更有利于患者治療，重新定義的跨病程和跨區(qū)域中的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對于預(yù)測患者生存上也更具優(yōu)勢。CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)是抗腫瘤免疫的關(guān)鍵，而近期有研究在小鼠中發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)的反應(yīng)也必不可少，進(jìn)一步通過IMC與多技術(shù)聯(lián)用證明了淋巴結(jié)內(nèi)的抗腫瘤T細(xì)胞也能被激活，可能在人類抗腫瘤免疫反應(yīng)中同樣起著重要作用[35]。雖然目前只有小部分實(shí)體瘤對免疫療法有反應(yīng)，但激活淋巴結(jié)的免疫反應(yīng)或許會引發(fā)在治療期間是否要將淋巴結(jié)留在體內(nèi)的重要思考。

用IMC檢測細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)，對探討腫瘤免疫調(diào)節(jié)能力也十分有利，一系列應(yīng)用表明，完整測繪腫瘤生態(tài)使得精確的免疫腫瘤學(xué)成為可能。鑒于免疫檢查點(diǎn)阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）是針對細(xì)胞間的相互作用，研究者通過IMC精確描繪了多細(xì)胞空間組織對免疫治療反應(yīng)的影響[30]，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表型、激活狀態(tài)和空間組織共同決定了ICB效應(yīng)，表明ICB獨(dú)特地重塑了腫瘤的結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵的ICB反應(yīng)預(yù)測因素。在研究彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）時(shí)，研究者利用IMC考察患者淋巴結(jié)，發(fā)現(xiàn)不同微環(huán)境中CD8+ TIL-FRC的亞群組成和空間分布存在差異，并與患者生存相關(guān)[36]。此外，TME中基質(zhì)和免疫細(xì)胞的全景分析在一定程度上揭示了成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞（fibroblast reticular cells，F(xiàn)RC）在DLBCL中存在的免疫抑制作用，驗(yàn)證了恰當(dāng)?shù)奶幚砟茉鰪?qiáng)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tu‐mor infiltrates lymphocytes，TIL）毒性，為進(jìn)一步了解它們的激活狀態(tài)和不同免疫功能提供了新的信息。此外，免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)也是判斷預(yù)后、考核療效和開發(fā)新藥的指標(biāo)。例如，利用IMC證明了脂質(zhì)體納米顆粒（liposome nanoparticles，LNPs）在創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎（post-traumatic osteoarthritis，PTOA）小鼠模型中具有很好的免疫調(diào)節(jié)能力，并且同時(shí)發(fā)現(xiàn)了LNPs具有減少浸潤關(guān)節(jié)的免疫細(xì)胞數(shù)量及調(diào)節(jié)表型的能力[37]，證明使用的仿生脂質(zhì)體治療對先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞的浸潤能產(chǎn)生非凡的影響。

2.4 腫瘤異質(zhì)性

單細(xì)胞分析技術(shù)進(jìn)步取得的眾多發(fā)現(xiàn)改變了對腫瘤異質(zhì)性和可塑性以及潛在治療選擇的理解，IMC技術(shù)的發(fā)展豐富了單細(xì)胞空間層面上評估腫瘤異質(zhì)性的能力。其通過檢測同一區(qū)域的表達(dá)性差異，或同一類細(xì)胞是否突變后致癌，來判斷腫瘤空間異質(zhì)性（相同腫瘤不同區(qū)域的差異）與時(shí)間異質(zhì)性（原發(fā)性與繼發(fā)性腫瘤的區(qū)別）。目前，已有研究對GBM進(jìn)行單細(xì)胞分辨率水平的空間維度表征，通過解析TME中細(xì)胞狀態(tài)和空間關(guān)系的動態(tài)適應(yīng)，發(fā)現(xiàn)TME的改變與特定腫瘤亞群存在密切關(guān)系，證明了微環(huán)境干擾能決定GBM的時(shí)間異質(zhì)性[38]。當(dāng)研究者基于scRNA-seq構(gòu)建出GBM的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜后，再整合代謝組學(xué)（如matrixas‐sisted laser desorption ionization-imaging mass spectrometetry，MALDI-IMS）和蛋白組學(xué)（如IMC）數(shù)據(jù)能揭示局部區(qū)域腫瘤-宿主的相互依賴性，并進(jìn)一步解析其空間異質(zhì)性[24]。類似的，IMC與單細(xì)胞測序相結(jié)合也應(yīng)用于從轉(zhuǎn)錄組角度研究鼻咽癌惡性細(xì)胞的單細(xì)胞異質(zhì)性，以及單細(xì)胞分辨率下惡性細(xì)胞的空間分布特征，由此揭示了鼻咽癌免疫逃逸行為的多種模式，并首次鑒定出一種針對鼻咽癌TME的CD8+ NK細(xì)胞簇，具有增強(qiáng)的抗病毒功能[39]。2項(xiàng)技術(shù)聯(lián)用還用于檢測橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RMS）患者原代培養(yǎng)物的瘤內(nèi)異質(zhì)性，分析了侵襲性肺泡RMS亞型的侵襲性、化療耐藥性和進(jìn)展背后的發(fā)育狀態(tài)，并將RAS通路確定為有前途的治療靶點(diǎn)，對化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)具有治療意義[40]。腫瘤異質(zhì)性的評估還可針對蛋白相關(guān)的翻譯后修飾，有研究利用IMC分析了7種磷酸化蛋白和14種組蛋白的翻譯后修飾情況，發(fā)現(xiàn)了心肌缺血及再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）中激酶信號的空間差異和多種組蛋白修飾模式，揭示了IRI發(fā)病進(jìn)展過程中的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)和表觀遺傳變化[41]。

2.5 腫瘤發(fā)生、發(fā)展

探討腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制需要深度解讀其涉及的多種復(fù)雜過程，從空間水平追蹤同源樣本的腫瘤演進(jìn)過程并破譯腫瘤發(fā)展的復(fù)雜機(jī)制已逐漸成為研究熱點(diǎn)。在研究食管鱗狀細(xì)胞癌時(shí)，IMC提取的空間信息幫助揭示了TME中的基質(zhì)特征，腫瘤組織前沿區(qū)形成的纖維性屏障為侵襲前的微環(huán)境提供了準(zhǔn)備，并為阻礙免疫效應(yīng)細(xì)胞浸潤提供了便利，也為免疫細(xì)胞分布及其空間上的排他性提供了成因證據(jù)[42]?？梢?，TME的各種成分會被編排成特定的空間順序，以協(xié)調(diào)癌癥進(jìn)展過程中的各種功能。1項(xiàng)報(bào)道應(yīng)用高分辨率成像來研究免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制，因其從單個(gè)組織切片中捕獲了有關(guān)巨細(xì)胞動脈炎發(fā)病機(jī)制的主要信息，并對患者顳動脈中免疫和非免疫細(xì)胞進(jìn)行了深度分析，IMC被認(rèn)為是分析炎癥性疾病中免疫細(xì)胞的復(fù)雜組成、相互作用和解剖位置的關(guān)鍵工具[43]。IMC技術(shù)彌補(bǔ)了scRNA-seq在細(xì)胞復(fù)雜時(shí)空異質(zhì)性上的信息不足，以及常規(guī)轉(zhuǎn)錄組在單細(xì)胞層面的分析局限，對IRI后各解剖區(qū)域和時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了全面的單細(xì)胞分析[41]。通過探究疾病過程中細(xì)胞群落、信號通路和表觀遺傳學(xué)的時(shí)空調(diào)控圖譜，繪制了IRI成人心臟細(xì)胞表型的時(shí)空異質(zhì)性，闡明了單細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)及引起IRI病理重塑的重要機(jī)制，提供了細(xì)胞特異的新潛在治療靶點(diǎn)。針對高級別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer，HGSOC）的研究表明，基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的大量結(jié)果顯示iTME在卡鉑反應(yīng)中發(fā)揮作用，而在受治療的患者中確切機(jī)制尚不清楚，應(yīng)用IMC則有助于闡明細(xì)胞對卡鉑的自主反應(yīng)與其iTME之間的相互作用，進(jìn)而探討卡鉑耐藥性機(jī)制[25]。此外，有團(tuán)隊(duì)充分挖掘了CyTOF的技術(shù)優(yōu)勢，針對4種常用肝細(xì)胞癌（hepato‐cellular carcinoma，HCC）細(xì)胞系小鼠原位模型，應(yīng)用IMC深入分析其原位iTME，提供了不同模型的TME特征和抗PD-1反應(yīng)的綜合視圖，可用于研究不同的免疫抑制途徑或指導(dǎo)臨床前模型選擇[44]。

2.6 預(yù)后管理

組織的空間分析進(jìn)一步闡明了腫瘤與微環(huán)境的相互作用，有助于開發(fā)空間水平的生物標(biāo)志物來預(yù)測患者對療法的反應(yīng)以及預(yù)后情況，但以往的空間生物標(biāo)志物通常源自單個(gè)患者隊(duì)列或傳統(tǒng)成像技術(shù)，受限于患者數(shù)量和不同成像平臺間的數(shù)據(jù)壁壘，往往難以重復(fù)和應(yīng)用。而IMC的應(yīng)用拓展了分析的數(shù)據(jù)量并實(shí)現(xiàn)了跨平臺的互通，充足的統(tǒng)計(jì)能力和豐富的分析方法還能避免成像數(shù)據(jù)的過度擬合。有研究者對乳腺癌患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行了3種不同的多重成像技術(shù)分析并比較，基于IMC的結(jié)果與其他方法的一致性證實(shí)了其在腫瘤預(yù)后方面的價(jià)值[45]。同時(shí)，IMC參與的多技術(shù)聯(lián)用不僅發(fā)現(xiàn)了乳腺癌患者預(yù)后的新標(biāo)志物，還在測試以往空間生物標(biāo)志物的再現(xiàn)性中，驗(yàn)證或質(zhì)疑了它們的預(yù)后價(jià)值。針對肝內(nèi)膽管癌的治療選擇有限且預(yù)后不佳，且抗PD-L1免疫療法聯(lián)合吉西他濱/順鉑化療僅在少數(shù)膽道癌患者中出現(xiàn)反應(yīng)這一情況，有研究通過多技術(shù)聯(lián)用分析了治療方法在原位小鼠模型中的治療獲益機(jī)制，并提出了改進(jìn)的聯(lián)合治療方案，有助于克服肝內(nèi)膽管癌患者治療耐藥性和改善預(yù)后[46]。

大數(shù)據(jù)分析的普及也促進(jìn)了IMC技術(shù)的發(fā)展，對于多標(biāo)記定量的IMC圖像，人工智能處理系統(tǒng)將有利于挖掘出新的生物信息。將大量患者的IMC數(shù)據(jù)進(jìn)行整合后，基于更精確的多標(biāo)志物組合來構(gòu)建預(yù)測模型可為腫瘤準(zhǔn)確分層或評估提供一個(gè)有潛力的工具，在預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)方面表現(xiàn)出卓越的能力，有助于臨床醫(yī)生進(jìn)一步制定預(yù)后管理計(jì)劃。例如，有研究通過IMC表征了416例非小細(xì)胞肺癌樣本的免疫微環(huán)境特征，深入解析了160萬個(gè)細(xì)胞，分析了患者臨床結(jié)局和細(xì)胞免疫譜系及激活狀態(tài)的相關(guān)性，確定了與患者生存相關(guān)的分子特征及空間特征，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了可預(yù)測非小細(xì)胞肺癌術(shù)后疾病進(jìn)展的模型[47]。該研究將樣本以1 mm2為單位制成組織芯片后利用IMC掃描了35個(gè)標(biāo)志物，結(jié)合人工智能分析每個(gè)細(xì)胞與其相鄰細(xì)胞并劃分為鄰域，通過提取鄰域類別和生存時(shí)間特征證實(shí)了特定細(xì)胞間相互作用與患者生存率的關(guān)系，再次證明了免疫微環(huán)境中細(xì)胞的組織關(guān)系中蘊(yùn)含獨(dú)特的預(yù)后價(jià)值。還有團(tuán)隊(duì)開發(fā)了1種免疫突觸分析算法來研究TME中的免疫突觸作用，并在2例黑色素瘤患者樣本中發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞突觸的形成與T細(xì)胞增殖有關(guān)，當(dāng)擴(kuò)展到乳腺癌IMC圖像時(shí)則發(fā)現(xiàn)通過B細(xì)胞突觸可預(yù)測患者生存率[48]。

2.7 其他

基于金屬標(biāo)簽的檢測原理，IMC能夠直接檢測組織樣品中的化療藥物（如鉑），因此可用于分析鉑基化療患者的腫瘤與非腫瘤組織中的鉑水平。有團(tuán)隊(duì)研究了局部晚期胃癌患者術(shù)前化療后的腫瘤鉑水平與病理反應(yīng)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)術(shù)前化療72 d后的手術(shù)標(biāo)本中仍可檢測到鉑，而較高的腫瘤鉑濃度又能體現(xiàn)病理上的改善程度[49]。該團(tuán)隊(duì)還證明了奧沙利鉑治療后皮膚中的鉑沉積會持續(xù)數(shù)年，這將有助于解釋鉑相關(guān)周圍感覺神經(jīng)病變這類治療不良反應(yīng)的機(jī)制[50]。鉑類抗癌藥物雖然廣泛應(yīng)用于臨床，但其耐藥及不良反應(yīng)嚴(yán)重影響了療效并限制了使用，研究者們已把目光投向鉑類及其衍生物，或與鉑同主族/同周期的一些過渡金屬上（如鋨、銅等），以研發(fā)更高效安全的抗癌金屬配合物[51-53]。IMC技術(shù)與這些新藥物具有良好的適配性，可應(yīng)用于開發(fā)到驗(yàn)證的各個(gè)環(huán)節(jié)，為進(jìn)一步開發(fā)靶向性強(qiáng)、毒性低的藥物提供參考依據(jù)，對抗癌金屬藥物的更新迭代發(fā)揮重要作用。

3 技術(shù)小結(jié)

3.1 相較于其他免疫標(biāo)記技術(shù)

多重免疫標(biāo)記是當(dāng)前抗原檢測的常用方法，其中多重?zé)晒鈽?biāo)記的操作相對簡單，但隨著標(biāo)志物個(gè)數(shù)的增加不可避免地帶來串色重疊和光損傷等實(shí)際問題，雖然通過識別熒光壽命能在一個(gè)光譜通道中拆分出多個(gè)標(biāo)志物進(jìn)而實(shí)現(xiàn)單通道多色成像[54]，但其技術(shù)要求隨之增高，并可能導(dǎo)致更快的光漂白[55]。而IMC采用的金屬同位素標(biāo)記法，在基于經(jīng)典免疫組化流程的同時(shí)，通過質(zhì)譜測定金屬標(biāo)簽的方式避免了熒光信號的衰落和串色等問題，不僅提高了可同時(shí)檢測標(biāo)志物的個(gè)數(shù)還擴(kuò)展了抗體的可選擇性[56]。

MIBIscope技術(shù)基于多重離子束成像（multiplexed ion beam imaging，MIBI）并結(jié)合質(zhì)譜儀定量檢測，也實(shí)現(xiàn)了高精度空間蛋白質(zhì)組成像[57]。MIBIscope可以使用與IMC相同的抗體和染色方案，但樣本需要使用鍍金載玻片，且信號采集方式與IMC不同。因其主離子束不會破壞樣本組織，MIBI‐scope可選擇不同速率和分辨率多次重復(fù)采樣。IMC是基于金屬標(biāo)簽檢測開發(fā)，而MIBIscope能檢測并定量從氫到鈾的所有元素，因此還能檢測細(xì)胞內(nèi)源性元素。有報(bào)道利用12C和31P作為反染劑，定量了脾臟組織石蠟切片中的56Fe，并將其與巨噬細(xì)胞中血紅素加氧酶-1的數(shù)量關(guān)聯(lián)起來，重現(xiàn)了細(xì)胞間相互作用的軌跡[58]。

3.2 相較于其他空間質(zhì)譜成像技術(shù)

目前質(zhì)譜成像（imaging mass spectrometry，IMS）的本質(zhì)都是把樣本像素化分割，逐一離子化后利用質(zhì)譜檢測生成質(zhì)量峰圖，再經(jīng)軟件重構(gòu)形成空間圖像。結(jié)合不同的方法可發(fā)展出具有特定優(yōu)勢的分支技術(shù)，比如利用電噴霧電離原理分析小分子代謝物的DESI-IMS，或利用基質(zhì)噴涂輔助樣本電離檢測蛋白、多肽和脂質(zhì)的MALDI-IMS[59]。雖然能將檢測對象映射到原始樣品的2D或3D坐標(biāo)上，但由于質(zhì)量峰圖的非靶性，需要通過比對數(shù)據(jù)庫分析物質(zhì)分子量才能定性、定量和定位地獲取空間組織中的分子水平信息。而與流式技術(shù)相結(jié)合的IMC采用了另一種思路，金屬標(biāo)簽使其能靶向地檢測生物標(biāo)志物，更精確地描述空間組織結(jié)構(gòu)，定量和定位地提取細(xì)胞表型和相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)。然而，數(shù)據(jù)廣度的增加使得IMC需要更加繁雜的樣本前處理時(shí)間和更多的成本投入。1張F(tuán)FPE切片需要經(jīng)過脫蠟、抗原修復(fù)、抗體過夜孵育等操作才能進(jìn)行IMC檢測，而IMS前處理只需要脫蠟或基質(zhì)噴涂即可上機(jī)檢測。其操作會更便捷、耗時(shí)短、易上手。金屬標(biāo)簽的使用是IMC成本增加的主要原因，雖然多標(biāo)記的一次性檢測可以節(jié)省珍貴樣本和縮短檢測周期，但越多的標(biāo)記抗體將產(chǎn)生越大的成本。

4 結(jié)語

IMC較之傳統(tǒng)成像技術(shù)有更高的靈敏度，更強(qiáng)的分子特異性，能同時(shí)從組織樣本中原位檢測多種生物分子，1次數(shù)據(jù)采集即可獲得多種分子的空間分布信息和定量數(shù)據(jù)。因其高水平的多通道分析能力，樣本利用率和數(shù)據(jù)深度，已被廣泛應(yīng)用于癌癥研究的各個(gè)層面。通過挖掘和分析細(xì)胞間的相互作用，IMC能夠從細(xì)胞亞群功能鑒定到癌癥治療效果等多方面對腫瘤生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行深入全面的探究，在免疫腫瘤學(xué)領(lǐng)域具有獨(dú)特的潛在應(yīng)用價(jià)值。IMC可從細(xì)胞和癌組織樣本中同時(shí)獲取多靶標(biāo)數(shù)據(jù)，并能保留空間組織結(jié)構(gòu)，量化細(xì)胞亞群和相互作用信息，在面對TME的復(fù)雜性和異質(zhì)性時(shí)，有助于更好的理解癌癥進(jìn)展機(jī)制。另外，通過比對治療前后以及反應(yīng)者和無反應(yīng)者之間的TME，IMC及其空間分析方法可在發(fā)現(xiàn)特異性差異方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，由于IMC的數(shù)據(jù)采集速率目前一般在1 mm2/100 min，即使最新技術(shù)已提升至約5倍（Hyperion XTi，Standard BioTools，USA），但仍然難以用較少時(shí)間和成本獲得更大乃至整個(gè)切片區(qū)域的數(shù)據(jù)信息，只能劃分并選擇較小的ROI。另外，除了檢測儀器的投入，若要分析大量的患者組織樣本，其分析成本與組織切片中金屬標(biāo)記抗體的數(shù)量和切片表面積成正比。這些因素導(dǎo)致IMC目前仍是一種昂貴的檢測技術(shù)，實(shí)際上很難廣泛應(yīng)用于常規(guī)臨床診斷，仍需進(jìn)一步優(yōu)化工作流程，降低時(shí)間和成本。在癌癥精準(zhǔn)診療時(shí)代，隨著空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展，分子病理學(xué)將與反映癌癥組織結(jié)構(gòu)的空間數(shù)據(jù)進(jìn)一步結(jié)合，IMC能在破譯癌癥組織內(nèi)細(xì)胞表型、功能和相互作用，發(fā)現(xiàn)耐藥機(jī)制，探索診療標(biāo)志物等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，有助于開發(fā)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)新策略，并推動臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。

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（責(zé)任編輯：曾 玲）

本文引用格式：

黃一薇，向廷秀，劉星河，等. 質(zhì)譜流式成像技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2025，50（1）：6-13.