【摘 要】目的：探索C57BL/6J小鼠結(jié)腸上皮雌激素受體β（estrogen receptor β，ERβ）缺失對(duì)結(jié)腸色氨酸羥化酶-1（TPH1，trypto‐phan hydroxylase-1）和5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）水平的影響。方法：利用CRISPR-Cas9技術(shù)獲得Pvillin-Cre+/-小鼠、ERβflox+/-小鼠，通過(guò)配種繁殖最終獲得腸道ERβ敲除純合子組（ERβflox-/--Pvillin-Cre+/+，ERβCKO，n=5）、雜合子組（ERβflox+/--Pvillin-Cre+/+，ERβCKO+/-）（n=5）及同窩野生型（wild type，WT）小鼠。取6個(gè)月齡和12個(gè)月齡的各品系小鼠作為研究對(duì)象。結(jié)合蘇木素-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫印跡（Western blot，WB）和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）方法對(duì)各組小鼠腸道形態(tài)、腸道ERβ、5-HT和TPH1水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：基因鑒定驗(yàn)證腸道ERβCKO小鼠成功構(gòu)建后，WB顯示腸道ERβ水平明顯下調(diào)（P<0.05）。HE顯示腸道ERβ敲除后，腸道結(jié)構(gòu)完整性與腸道黏膜上皮的絨毛發(fā)育均異常。ELISA結(jié)果顯示，2個(gè)月齡段ERβCKO小鼠腸道5-HT水平較WT組小鼠下降明顯（P<0.05），且呈月齡依賴方式。IHC結(jié)果顯示，各組小鼠腸道均出現(xiàn)TPH1免疫陽(yáng)性表達(dá)，與WT小鼠相比，ERβCKO小鼠腸道TPH1免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少（P<0.05），免疫陽(yáng)性物表達(dá)量更低（P<0.05），但TPH1未呈現(xiàn)月齡依賴方式。結(jié)論：結(jié)腸ERβ下調(diào)可引起結(jié)腸TPH1蛋白和5-HT水平含量降低，繼而引發(fā)小鼠腸道功能異常，增加患腸道疾病的風(fēng)險(xiǎn)，這為以ERβ為靶點(diǎn)的腸道相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】雌激素受體β；色氨酸羥化酶-1；5-羥色胺；腸道

【中圖分類號(hào)】R361【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【收稿日期】2024-03-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：82371203）；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（編號(hào)：CSTB2023NSCQMSX0161）。

Exploring the effect of intestinal ERβ on enterogenic TPH1 and 5-HT levels using CRISPR-Cas9 technology

Hu Wenqiang1，Yang Qianxi1，He Guiqiong1，Luo Shifang2

（1. Neuroscience Research Center，Chongqing Medical University；2. Department of Human Anatomy，School of Basic Medical Sciences，Chongqing Medical University）

【Abstract】Objective：To investigate the effects of colonic epithelial estrogen receptor β（ERβ） deletion on colonic tryptophan hydroxy‐lase-1（TPH1） and 5-hydroxytryptamine（5-HT） levels in C57BL/6J mice. Methods：Pvillin-Cre+/- mice and ERβflox+/- mice were obtained using CRISPR-Cas9 technology，and intestinal ERβ knockout homozygous（ERβflox-/--Pvillin-Cre+/+，ERβCKO，n=5），heterozygous（ERβflox+/--Pvillin-Cre+/+，ERβCKO+/- n=5），and littermate wild-type（WT） mice were ultimately obtained by mating and breeding. Mice of each strain at 6 and 12 months of age were used for the study. Hematoxylin-eosin staining（HE），enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），Western blotting（WB），and immunohistochemistry（IHC） were used for determining the intestinal morphology and measuring intestinal ERβ，5-HT，and TPH1 levels of mice in each group. Results：After the successful construction of intestinal ERβCKO mice as verified by gene identification，WB showed that intestinal ERβ levels were significantly down-regulated（P<0.05）. HE showed abnormalities in intestinal structural integrity and intestinal mucosal epithelial villi development after intestinal ERβ knockdown. ELISA results showed that intestinal 5-HT levels of ERβCKO mice at 6 and 12 months of age were significantly decreased compared with those of WT mice（P<0.05），and the decrease was in a month-age-dependent manner. IHC results showed that TPH1 was expressed in the intestines of mice of all groups. However，ERβCKO mice showed a reduced number of TPH1 immuno‐reactive cells（P<0.05） and lower expression of immunoreactive substances（P<0.05） compared with WT mice，but the decline in TPH1 was not in a month-age-dependent manner. Conclusion：Down-regulation of colonic ERβ induces a decrease in colonic TPH1 protein and 5-HT levels，which subsequently triggers abnor‐mal intestinal function and increases the risk of developing intesti‐nal diseases in mice. This study is expected to provide a laboratory basis for the pathogenesis of ERβ-targeted intestinal diseases.

【Key words】estrogen receptor β；tryptophan hydroxylase-1；5-hy‐droxytryptamine；intestine

5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是一類單胺吲哚胺，其制備由必需氨基酸L-色氨酸（trypto‐phan，Trp）提供原料，然后通過(guò)色氨酸羥化酶（tryp‐tophan hydroxylase，TPH）來(lái)實(shí)現(xiàn)。TPH可分成TPH1和TPH2這2個(gè)亞型。TPH1亞型主要表現(xiàn)在腸嗜鉻細(xì)胞（enterochromaffin，EC）黏膜層上皮中，而TPH2亞型則主要在所有5-HT能神經(jīng)元中表達(dá)[1-3]。腸道中90%的5-HT儲(chǔ)存在EC細(xì)胞中，它能調(diào)節(jié)機(jī)體的進(jìn)食行為、學(xué)習(xí)記憶能力以及腸道功能。已有研究報(bào)道，5-HT水平異?？梢鹦∈蟪霈F(xiàn)焦慮抑郁樣行為[4-6]。同時(shí)也有研究指出，在慢性偏頭痛的嚙齒動(dòng)物模型中，焦慮和抑郁樣行為會(huì)隨著5-HT水平的升高而降低[7-8]。5-HT在癌癥和胃腸道疾病中也發(fā)揮著不同程度的功能，如腸易激綜合征（Irri‐table bowel syndrome，IBS）的發(fā)生可能與腸道內(nèi)5-HT水平異常有關(guān)[9-10]。

近年研究報(bào)道，中縫背核區(qū)（dorsal raphe，DRN）的TPH水平會(huì)受到雌激素β受體（estrogen receptor β，ERβ）水平影響[11]。作為雌激素受體的一種亞型，ERβ主要存在于生殖器官、海馬區(qū)以及結(jié)腸等部位[12-13]。已有研究表明，大腦中ERβ水平可影響5-HT合成過(guò)程的限速酶TPH，從而引起模型小鼠出現(xiàn)焦慮抑郁樣行為[14-16]。5-HT作為一種結(jié)腸內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其合成是否會(huì)受結(jié)腸ERβ水平的影響，目前少有報(bào)道。因此，本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建結(jié)腸上皮ERβ敲除（ERβCKO）模型小鼠，觀察ERβ CKO小鼠結(jié)腸TPH1以及5-HT含量的變化，從而進(jìn)一步探討結(jié)腸ERβ蛋白水平下降小鼠腸道功能異常的機(jī)制，以期為以ERβ為靶點(diǎn)的腸道相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

TPH1兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司（1∶1 000，DF6442），GAPDH購(gòu)自艾博抗（上海）公司（1∶5 000，ab8245），標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Affinity公司（1∶5 000，AF7021），全蛋白提取試劑盒（KGP250）、SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒（KGP113）、Western Blotting檢測(cè)試劑盒（KGP1201）、ECL檢測(cè)試劑盒（KGP1123）、Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒（KGA801）、預(yù)染蛋白分子量Marker（KGP441）；5-HT試劑盒（武漢云克隆公司，CEA808Ge） 。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為Pvillin-Cre+/-小鼠、ERβflox+/-小鼠[購(gòu)于賽業(yè)生物技術(shù)有限公司，ID：7，8，9（06-22-2021）]以及繁殖后產(chǎn)生的不同基因型的ERβ敲除小鼠，每5只1籠（籠子：545 mm×395 mm×200 mm），所有動(dòng)物均在重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，室內(nèi)維持溫度在（22±2） ℃，濕度在（55±5）%，光照與黑暗循環(huán)時(shí)間為12 h，所有小鼠均可自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)中小鼠的使用遵循3R原則，本研究符合作者所在單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[WDRM動(dòng)（復(fù)）字第2020008號(hào)]。

1.3 方法

1.3.1 ERβ基因敲除小鼠的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組 （1）小鼠配種繁殖步驟如下。①雌雄ERβflox+/-種鼠雜交產(chǎn)生ERβflox+/-小鼠。②雌雄Pvillin-Cre+/-種鼠雜交獲得Pvillin-Cre+/-小鼠。③將Pvillin-Cre+/-小鼠與ERβflox+/-小鼠雜交，得到ERβflox+/--Pvillin-Cre+/-小鼠。④將雌雄ERβflox+/--Pvillin-Cre+/-小鼠配種，獲得3種基因型小鼠：ERβflox-/--Pvillin-Cre+/+（ERβCKO）、ERβflox+/--Pvillin-Cre+/+（ERβCKO+/-）和ERβflox+/+-PvillinCre+/+（WT）。（2）小鼠基因鑒定如下。①剪鼠尾提取DNA。取出生后21 d小鼠鼠尾0.2 cm，使用快速提取試劑盒（購(gòu)自Takara公司）提取小鼠基因組DNA。②PCR擴(kuò)增。以各基因組為模板，F(xiàn)lox上游引物：5’-CGACTCTACCGATGGCTGTT-3’；下游引物：5’-ACCATCACCCTACAAGTAATGC-3’。Pvillin-Cre上游引物：5’-GGTGTTTGGTTTGGTTTCCTCTGC ATAAGA-3’，下游引物：5’-GCAGGTTTGGTTTGGTTTCCTCT GCATAAGA-3’；GAPDH上游引物：5’-GGAGGTGAAGCAG GCTCAATC-3’，下游引物5’-GAACCAAAGCATCGACCAGT-3’。PCR體系參見(jiàn)Takara說(shuō)明書(shū)。使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（Takara Bio Inc，JPN）擴(kuò)增鑒定片段，1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收條帶。（3）小鼠分組如下。取6個(gè)月齡和12個(gè)月齡的WT、ERβCKO+/-和ERβCKO小鼠作為研究對(duì)象，每組各5只。

1.3.2 組織樣本制備 在敲除小鼠建立后于6個(gè)月齡和12個(gè)月齡處理小鼠取材。0.1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，固定小鼠四肢后，快速打開(kāi)胸腔，用預(yù)冷的30 mL 0.9%生理鹽水進(jìn)行心尖灌注，灌注完畢后，冰上快速斷頭取近盲腸端的1～2 cm結(jié)腸組織，放入4%多聚甲醛固定，梯度乙醇75%、80%、90%，無(wú)水乙醇脫水。二甲苯透明，包埋蠟塊，冷卻并凝固后取出蠟塊。石蠟切片機(jī)切片，厚4 μm，進(jìn)行后續(xù)染色實(shí)驗(yàn)。剩余結(jié)腸組織采用液氮碾碎處理，存放于-80 ℃冰箱，蛋白測(cè)定備用。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色（haematoxylin and eosin stain，HE）實(shí)驗(yàn) 選取相同切面的石蠟切片放入37 ℃恒溫箱復(fù)溫60 min，常規(guī)脫蠟至水。使用 HE試劑盒（Solarbio，G1120）進(jìn)行染色。然后用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察結(jié)腸結(jié)構(gòu)。

1.3.4 免疫印跡（Western blot，WB）實(shí)驗(yàn) 取出液氮碾碎后的組織在冰上操作，在碾碎組織中加入RIPA裂解液（碧云天，P0013B），含1%蛋白酶抑制劑PMSF（Biosharp，BM507A-1）及1%磷酸酶抑制劑（碧云天，P1045-2）裂解，提取總蛋白，按說(shuō)明書(shū)采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。取10 μg總蛋白進(jìn)行SDS-Page電泳，蛋白Maker 3 μL，恒壓80伏特，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至NC膜。NC膜放入5%脫脂奶粉（碧云天，P0216）室溫2 h。抗體用一抗稀釋液稀釋（1∶1 000）后，4 ℃冰箱放置14～18 h。1×PBST漂洗10 min×3次，放入二抗兔或鼠稀釋液（1∶5 000）中，孵育1 h。NC膜用1×PBST漂洗10 min×3次，滴加顯影液，Image J軟件對(duì)灰度值分析，測(cè)定各條帶蛋白表達(dá)強(qiáng)弱。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemical staining，IHC）實(shí)驗(yàn) 選取相同切面的石蠟切片放入37 ℃恒溫箱復(fù)溫60 min，常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2去離子水室溫孵育10 min，1×PBS洗片10 min×3次，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液95 ℃水浴鍋中修復(fù)15 min，室溫靜置自然冷卻，5%牛血清蛋白，37 ℃封閉30 min，滴加適當(dāng)稀釋的一抗（1∶200），4 ℃過(guò)夜。37 ℃復(fù)溫30 min，PBS洗片，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶1 000），37 ℃孵育30 min，PBS洗片，滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物，37 ℃孵育30 min，在普通光學(xué)顯微鏡下DAB顯色，蘇木素染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在熒光顯微鏡下采圖并計(jì)數(shù)分析。

1.3.6 ELISA測(cè)定 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定小鼠結(jié)腸組織中5-HT的水平。將樣品（20 μg）置于5-HT抗體涂層微孔板中（320 pg/mL），37 ℃孵育40 min。用PH7.2-7.4的1×PBST洗滌液洗板3次（每孔均要加滿），每次3～5 min。加50 μL生物素化-5-HT 抗體，37 ℃孵育20 min。然后向孔內(nèi)加HRP-Strepavidine酶結(jié)合物并在37 ℃下孵育10 min。底物溶液在37 ℃下避光孵育15 min。加入100 μL停止液后，使用Bio-Rad分光光度計(jì)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度（absorbances，A）值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Image J軟件對(duì)圖片結(jié)果進(jìn)行分析，使用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析：3 組樣本及以上進(jìn)行雙因素方差分析檢驗(yàn)，2組樣本進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn)分析。使用Graph‐Pad Prism 9.0制作統(tǒng)計(jì)圖，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 從基因和蛋白水平驗(yàn)證腸道ERβ敲除小鼠成功構(gòu)建

首先提取小鼠鼠尾DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，泳道上出現(xiàn)了不同大小的條帶。經(jīng)分析比對(duì)提示，131 bp條帶對(duì)應(yīng)為WT小鼠，出現(xiàn)131 bp和198 bp 2個(gè)規(guī)則條帶對(duì)應(yīng)為ERβCKO+/-小鼠，而198 bp條帶對(duì)應(yīng)ERβCKO小鼠（圖1A）。

緊接著通過(guò)WB測(cè)定各組小鼠結(jié)腸組織中ERβ蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，各組小鼠均出現(xiàn)55 kD大小的ERβ蛋白條帶（圖1B）。各組小鼠ERβ蛋白表達(dá)水平如下，6個(gè)月：WT組（1.000±0.157），ERβCKO+/-組（0.753±0.299），ERβCKO組（0.137±0.068），12個(gè)月：WT組（1.000±0.229），ERβCKO+/-組（0.580±0.192），ERβCKO組（0.205±0.032）。如圖1C所示，95%CI=-0.156 1～0.349 0。

以上結(jié)果表明，基于CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建的腸道ΕRβ敲除小鼠已成功獲得。因ERβCKO+/-組小鼠各指標(biāo)較不穩(wěn)定，以下實(shí)驗(yàn)不進(jìn)行分析。

2.2 各組小鼠的結(jié)腸組織標(biāo)本和病理形態(tài)HE染色

接下來(lái)本實(shí)驗(yàn)采用HE染色法觀察小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)。由圖2鏡下觀察可見(jiàn)，各月齡WT組小鼠腸道上皮中腸壁的腺體數(shù)量豐富，結(jié)構(gòu)排列整齊，隱窩結(jié)構(gòu)完整（圖2A）。如圖2A所示，ERβCKO組小鼠結(jié)腸黏膜組織上皮絨毛萎縮且染色較淺，腸絨毛基底部完整性破壞（圖2A）。提示腸道ERβ缺失后可造成純合子小鼠的結(jié)腸病理?yè)p傷和腸組織黏膜破壞。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)：相比于WT組小鼠，ERβCKO組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度未發(fā)生明顯改變（圖2B）。

2.3 各組小鼠結(jié)腸5-HT水平變化

采用ELISA測(cè)定各組小鼠腸源性5-HT水平。結(jié)果表明（圖3A），與WT組[6個(gè)月：（749.06±62.61） pg/mL，12個(gè)月：（558.55±38.20） pg/mL]相比，ERβCKO組小鼠腸道的5-HT水平[6個(gè)月：（486.23±58.70） pg/mL，12個(gè)月：（270.90±33.38） pg/mL]均呈下降趨勢(shì)。經(jīng)雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)（圖3A，95%CI=121.7～394.8），與6個(gè)月WT組小鼠比較，6個(gè)月齡ERβCKO組小鼠結(jié)腸5-HT水平降低（t=3.219，P=0.010），12個(gè)月齡ERβCKO小鼠結(jié)腸5-HT水平相比于12個(gè)月WT小鼠也明顯下降（t=5.357，P=0.001），提示腸道ERβ敲除可明顯減少5-HT水平。

采用非配對(duì)t檢驗(yàn)法（圖3B、3C）對(duì)6個(gè)月齡和12個(gè)月齡小鼠做年齡縱向比較，圖3B：95%CI=-666.0～-116.3，圖3C：95%CI=-594.8～230.5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ERβCKO組小鼠中，12個(gè)月齡組的5-HT水平較6個(gè)月組下降了44.4%（t=5.808，P= 0.010），而WT組2個(gè)月齡組也出現(xiàn)了下降，但僅下降25.5%（t= 4.016，P=0.030）。提示雖然年齡因素在5-HT水平下降上起了一定的作用，但ERβ缺乏導(dǎo)致的5-HT水平下降更為明顯。

2.4 各組小鼠結(jié)腸內(nèi)TPH1表達(dá)變化

明確ERβ敲除對(duì)腸源性5-HT的影響后，接下來(lái)對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行免疫組化染色，觀察5-HT合成過(guò)程關(guān)鍵限速酶TPH1的變化。結(jié)果顯示，TPH1免疫陽(yáng)性細(xì)胞廣泛見(jiàn)于各組小鼠結(jié)腸上皮黏膜層底部，免疫陽(yáng)性物質(zhì)主要表達(dá)于黏膜層細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。經(jīng)計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)（圖4A），高倍視野下（40倍）WT組小鼠腸道TPH1免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量（表1），非配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果表明，ERβCKO組小鼠TPH1免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯下降（6個(gè)月：t=8.633，P=0.002；12個(gè)月：t=3.082，P=0.011）。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)各組小鼠TPH1免疫陽(yáng)性細(xì)胞的染色深淺進(jìn)行陽(yáng)性面積百分比測(cè)定，結(jié)果顯示，與WT組小鼠陽(yáng)性面積百分比相比，ERβCKO小鼠為也呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)（表1）。圖4D的95%CI=-1.026～0.722。經(jīng)雙因素方差統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與WT 2個(gè)月齡組小鼠相比，ERβCKO小鼠腸道TPH1免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及染色深淺均明顯下降（圖4A，4C，P< 0.05）。提示ERβ對(duì)TPH1水平無(wú)明顯影響。采用非配對(duì)t檢驗(yàn)法結(jié)果表明（圖4A，4D），相比于6個(gè)月組小鼠，12個(gè)月組小鼠TPH1的染色深度均無(wú)明顯變化（表1），圖4E的95%CI=-23.10～13.50。圖4F的95%CI=7.179～1.154。提示年齡因素對(duì)TPH1水平無(wú)明顯影響。

以上結(jié)果跟WB檢測(cè)到的結(jié)果一致（圖4B，4C），各組小鼠TPH1蛋白表達(dá)：[6個(gè)月：WT組（1.000±0.190），ERβCKO組（0.237±0.066），12個(gè)月：WT組（1.000±0.080），ERβCKO組（0.279±0.037）]，圖4C的95%CI=-0.156～0.349。即2個(gè)月齡段ERβCKO組小鼠腸道TPH1蛋白水平較同月齡段WT組[6個(gè)月：（t=0.618，P=0.004），12個(gè)月：（t=0.248，P=0.01）]明顯下降（圖4B，4C）。

以上結(jié)果均提示，腸道ERβ缺乏可降低TPH1的表達(dá)。

3 討 論

腸道5-HT水平異?？赡軙?huì)誘發(fā)腸道疾病，有研究指出5-HT水平異?？赡芤鹞改c道感覺(jué)障礙和動(dòng)力紊亂，與IBS的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。關(guān)于腸道疾病如IBS，慢性結(jié)腸炎等，尚缺乏有效的治療策略。因此，通過(guò)某種手段調(diào)控腸道5-HT水平，有望為腸道疾病治療提供有效途徑。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了ERβCKO小鼠發(fā)現(xiàn)：①ERβCKO小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整性受損，絨毛形態(tài)紊亂。②腸道5-HT水平以及關(guān)鍵酶TPH1水平均下降。提示腸道ERβ缺失后，可能影響TPH1水平從而影響腸道5-HT合成。

5-HT廣泛分布于全身，其中大腦和腸道均為5-HT的重要來(lái)源，腦內(nèi)5-HT能神經(jīng)元主要位于腦干中縫核內(nèi)，其產(chǎn)生的5-HT占全身來(lái)源的5%，它可以產(chǎn)生5-HT能投射，在對(duì)認(rèn)知功能重要的區(qū)域，如隔膜核，額葉皮層，及海馬體形成中起重要作用[17]。而全身95%的5-HT主要來(lái)源于腸道[18]，腸道內(nèi)的5-HT主要由腸道黏膜上皮EC細(xì)胞合成并儲(chǔ)存[19]，并釋放到全身而參與生理過(guò)程。因此，通過(guò)調(diào)控腸道5-HT和合成5-HT限速酶TPH水平可能為認(rèn)知功能障礙與腸道疾病的防治提供靶點(diǎn)。

研究表明，雌激素可以促進(jìn)5-HT的合成，該過(guò)程與ERβ有關(guān)。ERβ主要分布于腦和外周器官如腸道、前列腺、肺等[20]。腸道尤其是結(jié)腸，主要表達(dá)ERβ，可維持結(jié)腸上皮正常的生理結(jié)構(gòu)[21]，本研究的HE結(jié)果也表明，結(jié)腸ERβ缺失會(huì)損傷結(jié)腸絨毛與腸壁結(jié)構(gòu)完整性，這與現(xiàn)有報(bào)道一致。腸道ERβ是腸道疾病如克羅恩病、胃食管反流病等的重要靶點(diǎn)，腸道ERβ的缺乏是否影響以及如何影響腸道5-HT及其關(guān)鍵酶類TPH1尚不清楚。

有研究報(bào)道，雌激素可通過(guò)腦內(nèi)ERβ基因組調(diào)節(jié)質(zhì)膜單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（PMAT）的表達(dá)，抑制5-HT的再攝取，提高腦內(nèi)5-HT的水平[22]。雌激素還可通過(guò)腦干DRN區(qū)的ERβ水平提高5-HT能細(xì)胞的數(shù)量[23]。本研究發(fā)現(xiàn)：6個(gè)月齡ERβ腸敲雜合子小鼠腸道組織中5-HT水平出現(xiàn)下調(diào)，純合子小鼠下降更明顯。與6個(gè)月齡小鼠相比，12個(gè)月齡的同組小鼠，隨年齡增加，腸道5-HT均出現(xiàn)了下調(diào)，尤其是純合子小鼠變化最為明顯。本研究結(jié)果與腦內(nèi)報(bào)道一致。有報(bào)道稱，ERβ可能通過(guò)5HT1A及其下游GABA能神經(jīng)傳遞的調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)節(jié)5-HT水平。本研究還發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是正常還是ERβ腸敲小鼠，12個(gè)月齡小鼠5-HT水平均比同組6個(gè)月齡小鼠更低。說(shuō)明5-HT水平會(huì)受到年齡因素影響，目前未有相關(guān)報(bào)道。

TPH1作為一種參與5-HT合成的限速酶，由腸內(nèi)分泌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等其他非神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)[24]。TPH1已被證實(shí)與消化系統(tǒng)疾病相關(guān)，在一項(xiàng)關(guān)于結(jié)直腸癌小鼠模型的研究中觀察到小鼠TPH1水平顯著升高，這可能會(huì)促進(jìn)腸道炎癥發(fā)生[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于野生型組，純合子組小鼠結(jié)腸上皮的TPH1陽(yáng)性細(xì)胞與蛋白水平均下降。有研究指出，ERβ的核轉(zhuǎn)錄因子可與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，或與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而以組織特異性方式增加或減少基因表達(dá)。研究人員通過(guò)對(duì)絕育獼猴進(jìn)行雌激素處理，增加了獼猴中縫背核中TPH1基因的表達(dá)[23]。結(jié)果支持ERβ與TPH1的啟動(dòng)子區(qū)域或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合改變基因表達(dá)的觀點(diǎn)。另有報(bào)道指出，人類TPH基因啟動(dòng)子區(qū)域鑒定非典型的cAMP，它可結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子NFY和SP1，并允許通過(guò)cAMP調(diào)節(jié)TPH1表達(dá)和絲裂原激活蛋白激酶[26]。因此，TPH1表達(dá)的激素調(diào)節(jié)可能是通過(guò)這些信號(hào)級(jí)聯(lián)的雌激素受體激活來(lái)間接進(jìn)行的。

綜上，本研究通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了ERβCKO小鼠，觀察到腸道ERβ缺乏會(huì)引起腸道TPH1和5-HT含量下降，進(jìn)而會(huì)對(duì)腸道疾病產(chǎn)生影響，為臨床上腸道相關(guān)疾病的防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。未來(lái)，本課題組將深入研究結(jié)腸ERβ對(duì)5-HT合成與代謝相關(guān)通路的影響，以闡明腸道ERβ對(duì)5-HT的調(diào)控機(jī)制以及其與疾病的關(guān)聯(lián)性，這可能為腸道疾病的臨床治療提供有效策略。

參考文獻(xiàn)

[1] Walther DJ，Peter JU，Bashammakh S，et al. Synthesis of serotonin by a second tryptophan hydroxylase isoform[J]. Science，2003，299（5603）：76.

[2] Booij L，Turecki G，Leyton M，et al. Tryptophan hydroxylase（2）gene polymorphisms predict brain serotonin synthesis in the orbitofron‐tal cortex in humans[J]. Mol Psychiatry，2012，17（8）：809-817.

[3] Zhang XD，Beaulieu JM，Sotnikova TD，et al. Tryptophan hydroxy‐lase-2 controls brain serotonin synthesis[J]. Science，2004，305（5681）：217.

[4] Freeman EW. Associations of depression with the transition to menopause[J]. Menopause，2010，17（4）：823-827.

[5] 劉 暢，王 瀟，劉芳，等. 厚樸酚對(duì)便秘型腸易激綜合征大鼠5-HT通路及腸道菌群的影響[J]. 中成藥，2023，45（9）：3067-3072. Liu C，Wang X，Liu F，et al. Effects of magnolol on 5-ht pathway and in‐testinal flora in rats with constipation irritable bowel syndrome[J]. Chin Tradit Pat Med，2023，45（9）：3067-3072.

[6] ？aksen H. The effects of parental divorce on children[J]. Psychi‐atriki，2022，33（1）：81-82.

[7] Cojocariu R，Ciobica A，Balmus IM，et al. Antioxidant capacity and behavioral relevance of a polyphenolic extract of Chrysanthellum ameri？ canum in a rat model of irritable bowel syndrome[J]. Oxid Med Cell Lon‐gev，2019，2019：3492767.

[8] Zhang MJ，Liu YF，Zhao MS，et al. Depression and anxiety behav‐iour in a rat model of chronic migraine[J]. J Headache Pain，2017，18（1）：27.

[9] Ye D，Xu HJ，Tang QL，et al. The role of 5-HT metabolism in can‐cer[J]. Biochim Biophys Acta Rev Cancer，2021，1876（2）：188618.

[10] Gao J，Xiong TT，Grabauskas G，et al. Mucosal serotonin reuptake transporter expression in irritable bowel syndrome is modulated by gut microbiota via mast cell-prostaglandin E2[J]. Gastroenterology，2022，162（7）：1962-1974.

[11] Gundlah C，Alves SE，Clark JA，et al. Estrogen receptor-beta regulates tryptophan hydroxylase-1 expression in the murine midbrain raphe[J]. Biol Psychiatry，2005，57（8）：938-942.

[12] 梅春霞，王嘉良，唐 楠，等.應(yīng)用雌激素受體β抑制劑建立腸道屏障受損的便秘動(dòng)物模型[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2024，10（5）：35-41. Mei CX，Wang JL，Tang N，et al.Establishment of constipation animal model with impaired intestinal barrier by estrogen receptorβinhibitors[J]. Food Ferment Ind，2024，10（5）：35-41.

[13] 武 鳳，劉俊岑，徐紅丹，等. 補(bǔ)骨脂提取物對(duì)APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬中雌激素受體表達(dá)的影響[J]. 中藥材，2022，45（7）：1699-1704. Wu F，Liu JC，Xu HD，et al. Effects of psoraleae fructus extract on learn‐ing and memory ability and estrogen receptor expression in hippocam‐pus of APP/PS1 mice[J]. J Chin Med Mater，2022，45（7）：1699-1704.

[14] Benmansour S，Privratsky AA，Adeniji OS，et al. Signaling mecha‐nisms involved in the acute effects of estradiol on 5-HT clearance[J]. Int J Neuropsychopharmacol，2014，17（5）：765-777.

[15] Wang B，Shi HX，Ren LY，et al. Ahi1 regulates serotonin produc‐tion by the GR/ERβ/TPH2 pathway involving sexual differences in de‐pressive behaviors[J]. Cell Commun Signal，2022，20（1）：74.

[16] Donner N，Handa RJ. Estrogen receptor beta regulates the expres‐sion of tryptophan-hydroxylase 2 mRNA within serotonergic neurons of the rat dorsal raphe nuclei[J]. Neuroscience，2009，163（2）：705-718.

[17] Bretsky PM，Buckwalter JG，Seeman TE，et al. Evidence for an in‐teraction between apolipoprotein E genotype，gender，and Alzheimer dis‐ease[J]. Alzheimer Dis Assoc Disord，1999，13（4）：216-221.

[18] Sz？ke H，Kovács Z，Bókkon I，et al. Gut dysbiosis and serotonin：intestinal 5-HT as a ubiquitous membrane permeability regulator in host tissues，organs，and the brain[J]. Rev Neurosci，2020，31（4）：415-425.

[19] Dodds KN，Travis L，Kyloh MA，et al. The gut-brain axis：spatial relationship between spinal afferent nerves and 5-HT-containing en‐terochromaffin cells in mucosa of mouse colon[J]. Am J Physiol Gastroin‐test Liver Physiol，2022，322（5）：G523-G533.

[20] Younes M，Honma N. Estrogen receptor Β[J]. Arch Pathol Lab Med，2011，135（1）：63-66.

[21] Principi M，Barone M，Pricci M，et al. Ulcerative colitis：from in‐flammation to cancer. Do estrogen receptors have a role？[J]. World J Gastroenterol，2014，20（33）：11496-11504.

[22] Katzenellenbogen JA，O’Malley BW，Katzenellenbogen BS. Tri‐partite steroid hormone receptor pharmacology：interaction with multiple effector sites as a basis for the cell- and promoter-specific action of these hormones[J]. Mol Endocrinol，1996，10（2）：119-131.

[23] Pecins-Thompson M，Brown NA，Kohama SG，et al. Ovarian ste‐roid regulation of tryptophan hydroxylase mRNA expression in rhesus macaques[J]. J Neurosci，1996，16（21）：7021-7029.

[24] C？té F，Schussler N，Boularand S，et al. Involvement of NF-Y and Sp1 in basal and cAMP-stimulated transcriptional activation of the tryptophan hydroxylase （TPH） gene in the pineal gland[J]. J Neuro‐chem，2002，81（4）：673-685.

[25] Li T，F(xiàn)u B，Zhang X，et al. Overproduction of gastrointestinal 5-HT promotes colitis-associated colorectal cancer progression via en‐hancing NLRP3 inflammasome activation[J]. Cancer Immunol Res，2021，9（9）：1008-1023.

[26] Wood JL，Russo AF. Autoregulation of cell-specific MAP kinase control of the tryptophan hydroxylase promoter[J]. J Biol Chem，2001，276（24）：21262-21271.

（責(zé)任編輯：曾 玲）

本文引用格式：

呼文強(qiáng)，楊千嬉，賀桂瓊，等. 利用CRISPR-Cas9技術(shù)探究腸道ERβ對(duì)腸源性TPH1和5-HT水平的影響[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2025，50（1）：37-43.