關(guān)鍵詞三蟲通絡(luò)散結(jié)方；Lewis肺癌細(xì)胞；增殖；侵襲；轉(zhuǎn)移；凋亡；PHD2/HIF-1α通路

肺癌是全球較常見的癌癥之一，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年約有200萬新發(fā)肺癌患者，因肺癌導(dǎo)致死亡的患者約176萬例[1]。肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩大類，其中非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要類型，占所有原發(fā)性肺癌的80%～85%[2]。在我國，肺癌是發(fā)病率、死亡率均最高的惡性腫瘤[3]。晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床治療主要包括靶向治療、化療、免疫治療及抗血管生成治療，但靶向藥物只對特定的靶點(diǎn)突變?nèi)巳河行?，且不可避免會出現(xiàn)耐藥；化療毒副作用大，緩解期短；單藥免疫治療對整體人群有效率低；新近的熱點(diǎn)抗體耦聯(lián)藥物數(shù)據(jù)尚不成熟，還處于研發(fā)階段[4―5]。因此，亟待尋找更加有效的肺癌治療方法。

中醫(yī)藥具有高效、低毒、副作用小、受眾面廣等特點(diǎn)，在腫瘤治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢。有研究發(fā)現(xiàn)，中藥能通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）/胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellularregulatedproteinkinases，ERK）、c-Jun氨基端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白等信號通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)，來降低腫瘤細(xì)胞活性，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)減輕放療對免疫功能的損傷，增強(qiáng)化療藥物效果并減弱其毒性，改善骨髓抑制[6―8]。三蟲通絡(luò)散結(jié)方是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，總結(jié)名家經(jīng)驗(yàn)并經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第七臨床醫(yī)學(xué)院（簡稱“我院”）長期臨床實(shí)踐擬定的協(xié)定處方，該方由全蝎、壁虎和蜈蚣組成，主要用于晚期肺癌的輔助治療。筆者在前期臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，三蟲通絡(luò)散結(jié)方有延長晚期肺癌患者生存期、延長疾病無進(jìn)展生存期的優(yōu)勢，但是否可抑制Lewis肺癌細(xì)胞增殖和凋亡尚未明確?；诖耍狙芯靠疾炝巳x通絡(luò)散結(jié)方對Lewis肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機(jī)制，以進(jìn)一步明確該方對肺癌的治療作用，旨在為肺癌的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括MultiskanMK3型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]、CIB-191C型CO2培養(yǎng)箱（美國CTI公司）、WSF-1600型倒置熒光顯微鏡（廣州微域光學(xué)儀器有限公司）、L500型臺式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、CKX41型顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]、BG-Power600i型電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司）、FACSCanto型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

全蝎、壁虎、蜈蚣飲片（批號分別為Q333212、B5473113、2303083）均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬寶安中醫(yī)院提供，經(jīng)該院藥學(xué)部梅全喜主任藥師鑒定均為真品；三蟲通絡(luò)散結(jié)膠囊由我院藥物臨床應(yīng)用中心制備，內(nèi)容物為全蝎、壁虎、蜈蚣飲片按制劑工藝打碎研磨后的混合物，每粒0.5g（以生藥量計(jì)，下同）。

順鉑注射液（批號601220104，規(guī)格6mL∶30mg）購自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司；胎牛血清、胰酶（批號分別為F8318-500ML、25200072）均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；CCK-8試劑盒（批號CK04）購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；4%多聚甲醛固定液（批號R20479）購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號8123233）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；聚偏二氟乙烯膜（批號IPVH00010）購自密里博中國有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號556547）購自美國BD公司；磷酸酶抑制劑、二辛可酸法蛋白含量檢測試劑盒、RIPA裂解液（批號分別為P1045、P0011、P0013）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL顯色液（批號FP302）購自安迪福諾生物科技（武漢）有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠、山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號分別為BA1050、BA1054）均購自武漢博士德生物工程有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號BF0198）購自江蘇親科生物研究中心有限公司；兔源血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α）、脯氨酰羥化酶2（prolylhydroxylase-2，PHD2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrixmetalloproteinase-2，MMP-2）抗體（批號分別為ab214424、ab179483、ab226890、ab181286）均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；兔源ERK、JNK、p38MAPK抗體（批號分別為#4695、#9252、#8690）均購自賽信通（上海）生物試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞

雄性SD大鼠44只，清潔級，體重（200±20）g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2022-0002。所有大鼠均飼養(yǎng)于廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司，飼養(yǎng)室溫度25℃、相對濕度40%，大鼠自由攝食及飲水。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株（批號20221123）購自上海安為生物科技有限公司。本研究方案經(jīng)廣州邁爾斯生物科技有限公司動物倫理委員會審批通過，批件號為20230014。

2 方法

2.1 藥液的制備

三蟲通絡(luò)散結(jié)方由全蝎10g、壁虎10g、蜈蚣6g組成。取上述飲片，加入清水300mL，煎煮出藥液123mL，藥液質(zhì)量濃度為0.21g/mL，于4℃儲存?zhèn)溆茫吹脺珓┙M藥液。取三蟲通絡(luò)散結(jié)膠囊內(nèi)容物，以生理鹽水為溶劑溶解稀釋成相應(yīng)濃度藥液，即得散劑組藥液。

2.2 血清的制備

取44只SD大鼠，隨機(jī)分為散劑組、湯劑組、陽性對照組和陰性對照組，每組11只。根據(jù)人的使用劑量，按照體表面積折算法[9]換算大鼠的等效劑量，即散劑組大鼠按0.946g/（kg·d）灌胃相應(yīng)藥液，湯劑組大鼠按2.730g/（kg·d）灌胃相應(yīng)藥液，陰性對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天灌胃2次，連續(xù)給藥5d。按照相關(guān)文獻(xiàn)[10―12]折算出大鼠的順鉑使用劑量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置陽性對照組大鼠的給藥劑量，即陽性對照組大鼠按4.2mg/kg腹腔注射順鉑注射液，隔日1次，即第1、3、5天給藥。末次給藥后1～2h，腹腔注射三溴乙醇麻醉各組大鼠，經(jīng)腹主動脈取血，分離血清；合并同組血清，滅活，濾過，除菌，制得散劑血清、湯劑血清、陽性對照血清和陰性對照血清，均于－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細(xì)胞分組與干預(yù)

2.3.1 三蟲通絡(luò)散結(jié)方含藥血清的最佳干預(yù)濃度篩選

取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞，以胰酶消化，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105個(gè)/mL，以每孔100μL細(xì)胞懸液接種于96孔板。細(xì)胞分為8組，分別為陰性對照血清組、陽性對照血清組、5%散劑血清組、10%散劑血清組、20%散劑血清組、5%湯劑血清組、10%湯劑血清組、20%湯劑血清組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組分別給予“2.2”項(xiàng)下10%陰性對照血清、10%陽性對照血清和相應(yīng)濃度含藥血清干預(yù)，于干預(yù)前及干預(yù)24、48、72h后，每孔加入10%CCK-8溶液100μL，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，用酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的吸光度，計(jì)算增殖抑制率：增殖抑制率＝（1－藥物組吸光度/陰性對照血清組吸光度）×100%。根據(jù)增殖抑制率篩選三蟲通絡(luò)散結(jié)方含藥血清的最佳干預(yù)濃度。

2.3.2 藥物干預(yù)

取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞，以胰酶消化，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105個(gè)/mL，以每孔100μL細(xì)胞懸液接種于96孔板。根據(jù)“3.1”項(xiàng)下含藥血清濃度的篩選結(jié)果，將細(xì)胞分為陰性對照血清組、陽性對照血清組、20%散劑血清組和20%湯劑血清組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組分別給予10%陰性對照血清、10%陽性對照血清和相應(yīng)濃度含藥血清干預(yù)，于干預(yù)前及干預(yù)24、48h（根據(jù)“3.1”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置）后，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 細(xì)胞侵襲能力檢測

采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測。取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞，按“2.3.2”項(xiàng)下方法分組、處理。培養(yǎng)48h后，將3×104個(gè)細(xì)胞接種到涂有Matrigel基質(zhì)膠的小室上層，用200μL無血清培養(yǎng)基重懸；在下室中加入完全培養(yǎng)基700μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48h。孵育結(jié)束后，取出小室，吸棄上室培養(yǎng)基后，先將小室轉(zhuǎn)移至加有多聚甲醛的24孔板中，固定15min，然后用棉簽擦去上室細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖液洗滌3次，再用4%多聚甲醛固定20min，以磷酸鹽緩沖液洗滌3次，最后用結(jié)晶紫染色10min。使用顯微鏡觀察細(xì)胞侵襲數(shù)量并拍照，細(xì)胞侵襲數(shù)量越多說明侵襲能力越強(qiáng)。

2.4.2 細(xì)胞遷移能力檢測

采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測。將消化生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞數(shù)量為確保常規(guī)培養(yǎng)第2天剛好鋪滿板底。將細(xì)胞按“2.3.2”項(xiàng)下方法分組、處理，在6孔板上方放置無菌的尺子，用移液槍取200μL，槍頭垂直于孔板，沿著尺子劃痕，劃痕完畢，吸棄舊培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，去除劃下的細(xì)胞，使留下的劃痕間隙肉眼可見，然后更換新鮮無血清培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。使用顯微鏡觀察劃痕區(qū)寬度并拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移距離：細(xì)胞遷移距離＝0h劃痕區(qū)域?qū)挾龋?4h劃痕區(qū)域?qū)挾取?/p>

2.4.3 細(xì)胞凋亡情況檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞，按“2.3.2”項(xiàng)下方法分組、處理。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，以胰酶消化，離心收集細(xì)胞，加入磷酸鹽緩沖液300μL重懸細(xì)胞，再次離心，棄上清液，加入BindingBuffer50μL，混勻，加入AnnexinⅤ-FITC和PI各2.5μL，室溫避光孵育15min，離心，棄上清液，加入BindingBuffer300μL。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率＝（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.4.4 細(xì)胞中VEGF、HIF-1α、PHD2、MMP-2、ERK、JNK、p38MAPK蛋白表達(dá)檢測

采用WesternBlot法檢測。取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞，按“2.3.2”項(xiàng)下方法分組、處理。培養(yǎng)48h后，裂解細(xì)胞并提取蛋白，采用二辛可酸法測定蛋白濃度。蛋白加熱變性后，電泳分離并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，經(jīng)脫脂粉封閉，加入GAPDH、VEGF、HIF-1α、PHD2、MMP-2、ERK、JNK、p38MAPK一抗（稀釋比例均為1∶1000），于4℃孵育過夜；加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1∶1000），室溫孵育1h，洗膜后加入ECL顯色液曝光，掃描。應(yīng)用ImageJ軟件分析電泳條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 三蟲通絡(luò)散結(jié)方含藥血清的最佳干預(yù)濃度篩選結(jié)果

如圖1所示，與干預(yù)前比較，5%散劑血清組和5%湯劑血清組細(xì)胞干預(yù)24、48、72h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率呈先升高后降低的趨勢，以干預(yù)48h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率最高；陽性對照血清組、10%散劑血清組、20%散劑血清組、10%湯劑血清組和20%湯劑血清組細(xì)胞干預(yù)24、48、72h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率均明顯升高，且與作用時(shí)間呈正相關(guān)，其中干預(yù)48h時(shí)，20%散劑血清組和20%湯劑血清組細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率均不低于50%。故選取散劑血清和湯劑血清的最佳干預(yù)濃度均為20%。

3.2 細(xì)胞侵襲能力比較

與陰性對照血清組比較，陽性對照血清組、20%散劑血清組和20%湯劑血清組細(xì)胞的侵襲數(shù)量均顯著減少（P＜0.05）。結(jié)果見圖2和表1。

3.3 細(xì)胞遷移能力比較

如圖3所示，與干預(yù)前比較，干預(yù)24h時(shí)陽性對照血清組、20%散劑血清組和20%湯劑血清組細(xì)胞的劃痕區(qū)依舊明顯，而陰性對照血清組細(xì)胞的劃痕區(qū)變窄。與陰性對照血清組比較，陽性對照血清組、20%散劑血清組和20%湯劑血清組細(xì)胞的遷移距離均顯著減小（P＜0.05）；與陽性對照血清組比較，20%散劑血清組和20%湯劑血清組細(xì)胞的遷移距離均顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

3.4 細(xì)胞凋亡率比較

與陰性對照血清組比較，陽性對照血清組、20%散劑血清組和20%湯劑血清組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高（P＜0.05）；與陽性對照血清組比較，20%散劑血清組和20%湯劑血清組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高（P＜0.05）；與20%散劑血清組比較，20%湯劑血清組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4、表1。

3.5 細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平比較

與陰性對照血清組比較，陽性對照血清組和20%散劑血清組細(xì)胞中PHD2、p38MAPK蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），20%湯劑血清組細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與陽性對照血清組比較，20%湯劑血清組細(xì)胞中VEGF、HIF-1α、MMP-2、p38MAPK蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。與20%散劑血清組比較，20%湯劑血清組細(xì)胞中HIF-1α、JNK、p38MAPK蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖5和表2。

4 討論

大多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已屬晚期，化療、靶向治療和免疫治療等雖能改善肺癌患者的生存質(zhì)量，延長其生存期，但仍存在藥物毒性累積、藥物耐藥、價(jià)格昂貴等缺陷[4―5]。三蟲通絡(luò)散結(jié)方中全蝎、蜈蚣、壁虎均是治療肺癌的常用中藥，此方已在我院肺癌的治療中取得了良好的療效。方中壁虎咸寒，散結(jié)、祛風(fēng)、解毒，為君藥；全蝎辛平，通絡(luò)止痛、解毒散結(jié)，為臣藥；蜈蚣辛溫，能中和壁虎的寒性，息風(fēng)、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)，為佐藥。三藥合用，共奏扶正祛邪、通絡(luò)散結(jié)、祛風(fēng)、解毒的作用，然而其作用機(jī)制尚未闡明。本研究結(jié)果顯示，與陰性對照血清比較，三蟲通絡(luò)散結(jié)方散劑血清及其湯劑血清培養(yǎng)的Lewis肺癌細(xì)胞侵襲數(shù)量和遷移距離均顯著減少，凋亡率均顯著升高，表明三蟲通絡(luò)散結(jié)方可抑制Lewis肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移，促進(jìn)其凋亡。

硫化氫與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，HIF-1α受硫化氫調(diào)控，是血管生成的重要組成部分[13]，在肺癌的生成、轉(zhuǎn)移中具有重要作用[14]。PHD2被認(rèn)為是關(guān)鍵的氧傳感器，且更傾向于調(diào)節(jié)HIF-1α，能夠調(diào)節(jié)其活性和穩(wěn)定性，是降解HIF-1α的關(guān)鍵酶[15]。VEGF和MMP-2是促進(jìn)腫瘤微血管生長的細(xì)胞因子，可通過使毛細(xì)血管增生、新生血管形成等，促進(jìn)腫瘤生長和擴(kuò)散[16]。PHD2低表達(dá)會引起HIF-1α降解途徑中斷，導(dǎo)致HIF-1α聚積，從而引起下游靶基因（如VEGF、MMP-2）的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)、表達(dá)上調(diào)，最終誘導(dǎo)腫瘤血管增生；腫瘤細(xì)胞通過新生的血管獲得充足的養(yǎng)分，并由血循環(huán)流向靶器官，實(shí)現(xiàn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果顯示，與陰性對照血清比較，三蟲通絡(luò)散結(jié)方散劑血清培養(yǎng)的Lewis肺癌細(xì)胞中PHD2蛋白表達(dá)水平顯著升高，湯劑血清培養(yǎng)的Lewis肺癌細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明三蟲通絡(luò)散結(jié)方可能通過激活PHD2蛋白表達(dá)，增加HIF-1α降解，來抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。根據(jù)研究結(jié)果推測，PHD2/HIF-1α信號通路的下調(diào)可能部分介導(dǎo)了三蟲通絡(luò)散結(jié)方的抗腫瘤作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然三蟲通絡(luò)散結(jié)方散劑血清及其湯劑血清均能誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡，但兩者比較，散劑血清誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力更強(qiáng)；此外，散劑血清和湯劑血清細(xì)胞中VEGF、HIF-1α、PHD2、MMP-2、ERK、JNK、p38MAPK蛋白表達(dá)情況并不一致，提示三蟲通絡(luò)散結(jié)方散劑及其湯劑可能存在不同的作用機(jī)制及效應(yīng)。既往也有研究發(fā)現(xiàn)，中藥的不同劑型在成分、效應(yīng)等方面存在區(qū)別，如魏華民等[17]研究發(fā)現(xiàn)，中藥散劑和傳統(tǒng)湯劑在腫瘤學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)中有較大差別，指出雙參顆粒醇提產(chǎn)物較傳統(tǒng)湯劑對腫瘤細(xì)胞有更明顯的抑制增殖、遷移和促進(jìn)凋亡的作用，但兩者在抑制肺轉(zhuǎn)移方面無差別。

綜上所述，三蟲通絡(luò)散結(jié)方可抑制Lewis肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)其凋亡，作用機(jī)制可能與調(diào)控PHD2/HIF-1α信號通路相關(guān)；且散劑效果優(yōu)于湯劑，二者可能存在不同的作用機(jī)制。