摘要：葡萄球菌是郫縣豆瓣甜瓣子發(fā)酵階段的優(yōu)勢菌屬，對豆瓣醬的品質(zhì)具有顯著貢獻。為探明Staphylococcus菌株在甜瓣子發(fā)酵階段的形成機制，該研究結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)法和qPCR等技術(shù)考察了生物因素和非生物因素對不同Staphylococcus菌株的脅迫特性。結(jié)果表明，從甜瓣子發(fā)酵階段主要分離了4種Staphylococcus菌株，分別為S. gallinarum、 S. sciuri、 S. pasteuri和S. haemolyticus，其中，S. gallinarum的豐度最高，達70.6%。4株Staphylococcus菌株均具有較強的耐酸、耐鹽特性，其中，S. gallinarum的能力最強。與不同優(yōu)勢背景微生物的相互作用表明，S. gallinarum與B. licheniformis和Z. rouxii的生長存在競爭關(guān)系，與B. amyloliquefaciens具有侵害關(guān)系，與T. halophilus具有偏利共生關(guān)系，而與C. etchellsii保持中性關(guān)系。該研究結(jié)果可為揭示親緣關(guān)系密切的Staphylococcus菌株在郫縣豆瓣發(fā)酵過程中的生態(tài)分布提供一定指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：郫縣豆瓣醬；葡萄球菌；脅迫；相互作用；qPCR

中圖分類號：TS264.24""""""文獻標志碼：A"""""文章編號：1000-9973（2025）02-0045-06

Study on Characteristics of Staphylococcus Strains in

Pixian Broad Bean Paste

ZUO Ao-teng， LU Yun-hao， HE Qiang^*

（College of Biomass Science and Engineering， Sichuan University， Chengdu 610065， China）

Abstract： Staphylococcus is the dominant genus during the fermentation of Pixian broad bean paste mash， which has a significant contribution to the quality of broad bean paste. In order to explore the formation mechanism of Staphylococcus strains during the fermentation of mash， traditional culture method and qPCR are adopted to investigate the stress characteristics of different Staphylococcus "strains under biotic and abiotic factors. The results show that four kinds of Staphylococcus strains are mainly isolated during the fermentation of mash， namely S. gallinarum， S. sciuri， S. pasteuri and S. haemolyticus. Among them， S. gallinarum has the highest abundance， reaching 70.6%. The four Staphylococcus strains all have strong "acid and salt tolerance， among which， S. gallinarum has the strongest ability. The interaction with microorganisms from different advantageous backgrounds indicates that S.gallinarum has a competitive relationship with the growth of B.licheniformis and Z.rouxii， an invasive relationship with B. amyloliquefaciens， a beneficial symbiotic relationship with T.halophilus， and a neutral relationship with C. etchellsii. The results can provide some guidance for revealing the ecological distribution of closely related Staphylococcus strains in the fermentation process of Pixian broad bean paste.

Key words： Pixian broad bean paste; Staphylococcus; stress; interaction; qPCR

郫縣豆瓣醬是我國著名的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，因其獨特的風(fēng)味和營養(yǎng)深受消費者的喜愛，素有“川菜之魂”的美譽^[1]。郫縣豆瓣醬的生產(chǎn)主要包括前期辣椒發(fā)酵和甜瓣子發(fā)酵，以及以成熟甜瓣子和辣椒醅按比例混合的后熟發(fā)酵階段^[2]。在整個發(fā)酵周期，復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)及不同菌株間的相互作用顯著影響郫縣豆瓣醬的品質(zhì)^[3]。Jiang等^[4]發(fā)現(xiàn)在低鹽豆瓣醬中接種Zygosaccharomyces rouxii和Tetragenococcus halophilus可顯著提高產(chǎn)品揮發(fā)性物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì)的含量，尤其是醇類、酸類、酯類物質(zhì)的水平。Lu等^[5]研究表明在豆瓣醬中接種Bacillus amyloliquefaciens與Candida versatilis同樣可提高產(chǎn)品揮發(fā)性化合物的含量，前者可增加酸類、含硫化合物和吡嗪類的濃度，而后者顯著促進了醇類、酯類和酚類物質(zhì)的積累。劉超蘭等^[6]在豆瓣醬醅中接種了耐鹽乳酸菌和酵母菌，發(fā)現(xiàn)接種組發(fā)酵8個月的醬醅揮發(fā)性組分接近自然發(fā)酵12個月的水平，極大地縮短了豆瓣醬的發(fā)酵周期。

大量研究表明，甜瓣子發(fā)酵階段是郫縣豆瓣醬生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，蠶豆中的蛋白質(zhì)和碳水化合物等大分子物質(zhì)在制曲過程中累積的酶系及環(huán)境微生物間的相互作用下，逐漸轉(zhuǎn)化成醇類、醛類、酸類、酯類等風(fēng)味化合物，形成了甜瓣子獨特的風(fēng)味，也最終決定了郫縣豆瓣醬的品質(zhì)^[7-8]。高通量測序數(shù)據(jù)表明Staphylococcus菌株是甜瓣子發(fā)酵階段的主要優(yōu)勢菌屬之一^[9-13]，且Staphylococcus菌株能利用多種底物作為生長因子，具有廣泛的代謝功能，對發(fā)酵制品的風(fēng)味形成有顯著的貢獻，因此，在眾多發(fā)酵食品中被用作起始發(fā)酵劑^[14-15]，如香腸^[16]、奶酪^[17]、腌魚^[18]等。然而，前期基于傳統(tǒng)培養(yǎng)法的結(jié)果表明Staphylococcus菌株僅在甜瓣子發(fā)酵前期占據(jù)優(yōu)勢地位，隨著發(fā)酵的進行，其含量逐漸降低。為了探明Staphylococcus菌株在甜瓣子發(fā)酵過程中的驅(qū)動特性，本研究考察了所分離的Staphylococcus菌株的環(huán)境耐受性及其與其他優(yōu)勢微生物間的相互作用，以期為Staphylococcus菌株在郫縣豆瓣醬產(chǎn)業(yè)化中的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1"材料與方法

1.1"材料與試劑

小麥粉、蠶豆粉、食鹽：購于本地超市；蠶豆醬醅：四川省某郫縣豆瓣公司提供。

氫氧化鈉、鹽酸、75%乙醇、無水乙醇、異丙醇：成都金山化學(xué)試劑有限公司；制霉菌素、SYBR Green Master Mix：翌圣生物科技（上海）股份有限公司；腦心浸液肉湯（BHI）、YPD液體培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基、TGE瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、雙蒸水（sterilized ddH₂O）、溶菌酶：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2"菌株

雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum，NCBI登錄號：OR282438）、巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri，NCBI登錄號：OR282447）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri，NCBI登錄號：OR282446）、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus，NCBI登錄號：OR282450）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens，NCBI登錄號：MK063714）、埃切假絲酵母（Candida etchellsii，NCBI登錄號：MK063704）、魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii，NCBI登錄號：MK063705）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis，NCBI登錄號：MK063711）、嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus，NCBI登錄號：MK063724）：均分離自郫縣豆瓣。

1.3"儀器與設(shè)備

BioTek微孔板檢測儀"美國伯騰儀器有限公司；QuantStudio^TMnbsp;3熒光定量PCR儀"美國賽默飛世爾科技公司；FiveEasy Plus pH計"瑞士梅特勒-托利多公司；HC-3018R高速冷凍離心機"安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺"蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱"上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SPH-2102培養(yǎng)振蕩器"上海世平實驗設(shè)備有限公司；LDZF-50L-Ⅰ立式高壓蒸汽滅菌鍋"上海申安醫(yī)療器械廠。

1.4"試驗方法

1.4.1"Staphylococcus菌株的分離、鑒定與統(tǒng)計

依據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》，在225 mL無菌生理鹽水中加入25 g蠶豆醬醅，120 r/min振蕩30 min，將勻液以10倍配比進行梯度稀釋。取合適的2～3個稀釋度的樣品勻液，在含有制霉菌素（50 μg/mL）的TGE瓊脂培養(yǎng)基上涂布，30 ℃培養(yǎng)48 h后，隨機挑取不同形態(tài)的單菌落，并用相應(yīng)的瓊脂平板進行分離純化，純化后的菌株使用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取DNA，并使用通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（CTA-CGGCTACCTTGTTACGA）進行16S rDNA擴增子測序。測序序列利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比對，通過MEGA 11.0軟件鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1 000次的bootstraps檢驗計算支持率。

1.4.2"菌株活化

將S. gallinarum、 S. pasteuri、 S. sciuri、 S. haemolyticus、B. amyloliquefaciens和B. licheniformis接種到50 mL營養(yǎng)肉湯中，在30 ℃、150 r/min條件下活化18 h；將C. etchellsii和Z. rouxii接種到50 mL YPD培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min條件下活化38 h。將T. halophilus接種到50 mL MRS培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)72 h。將上述活化2次后的菌液在4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min，棄上清液，用無菌生理鹽水清洗2～3次，調(diào)整初始接菌量約為10⁶"CFU/mL。

1.4.3"Staphylococcus菌株的生長與環(huán)境耐受性測定

將1 mL活化后的S. gallinarum、S. pasteuri、S. sciuri和S.haemolyticus（10⁶"CFU/mL）分別接種于49 mL BHI培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔4 h測量OD_{600 nm}值，直至菌株生長達到穩(wěn)定期。固定鹽濃度為12%，以相同生物量接種上述4株Staphylococcus菌株，通過測量在不同pH條件下（7.0，6.5，6.0，5.5，5.0，4.5）培養(yǎng)72 h的OD_{600 nm}值，評估其耐酸性。另外，固定BHI培養(yǎng)基初始pH為6.5，通過測量4株Staphylococcus菌株在不同鹽濃度下（0%、4%、8%、12%、16%、20%）培養(yǎng)72 h的OD_{600 nm}值，評估其耐鹽性。

1.4.4"Staphylococcus gallinarum與優(yōu)勢背景微生物的相互作用

模擬培養(yǎng)基的制備：稱取蠶豆粉30 g和小麥粉7.5 g，加入3 L超純水煮30 min，離心取上清液，加入12%食鹽并調(diào)節(jié)pH至6.5，隨后分裝為50 mL體系，經(jīng)121 ℃滅菌20 min后備用^[19]。

將1 mL活化后的S. gallinarum與B. amyloliquefaciens、B. licheniformis、 C. etchellsii、 Z. rouxii和T. halophilus以10⁶"CFU/mL接種于模擬液體培養(yǎng)基中進行單獨培養(yǎng)或兩兩組合共培養(yǎng)發(fā)酵，所有發(fā)酵均在30 ℃下進行3 d，并通過qPCR對發(fā)酵結(jié)束時不同物種的細胞數(shù)進行定量。

1.4.5"引物設(shè)計合成與標準品構(gòu)建

利用Oligo 7軟件設(shè)計試驗菌株的16S rDNA或26S rDNA序列特異性引物，通過NCBI中Primer-BLAST與SnapGene軟件進行驗證，引物序列見表1。選擇引物可特異性結(jié)合的目的基因序列（500 bp）構(gòu)建標準品質(zhì)粒，引物序列及質(zhì)粒構(gòu)建交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4.6"qPCR擴增

以總DNA為模板，利用特異性引物（見表1）進行qPCR測定。擴增體系見表2，程序參考Lu等^[5]的方法并作適當調(diào)整：50 ℃預(yù)熱3 min，95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)50次。擴增體系見表2。

1.4.7"標準品質(zhì)粒濃度的測定及標準曲線的建立

測定標準品質(zhì)粒的A_{260 nm}和A_{280 nm}值用于純度分析，并利用A_{260 nm}值和質(zhì)粒的分子質(zhì)量換算成標準品拷貝濃度（copies/mL），換算公式如下^[20]。將標準品質(zhì)粒以10倍配比梯度稀釋，以拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸，C_q值（擴增循環(huán)數(shù)）為Y軸繪制標準曲線，每個梯度重復(fù)測定4次。

拷貝數(shù)（C）= DNA amount（g/mL）×6.02×10²³（copies/mole）DNA length（bp）×660（g/mole/bp） =DNA copies/mL。

1.5"數(shù)據(jù)處理

通過Excel 2016、SPSS Statistics 26和Origin 2021對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與制圖。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2"結(jié)果與討論

2.1"qPCR標準曲線

用BioTek微孔板檢測儀測定標準品質(zhì)粒的DNA濃度，并將標準品質(zhì)粒按照公式計算出拷貝數(shù)，以10倍配比梯度稀釋，繪制標準曲線，結(jié)果見表3。各個標準品質(zhì)粒A_{260 nm}/A_{280 nm}均大于1.6，表明質(zhì)粒DNA純度較好，可用于qPCR試驗。回歸方程的相關(guān)系數(shù)均gt;0.99，表明結(jié)果的可信度高。

2.2"菌株的鑒定結(jié)果

采用純培養(yǎng)法對蠶豆醬醅發(fā)酵過程中的Staphylococcus菌株進行了分離鑒定，通過在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對分析，共篩選出4種Staphylococcus菌株，分別為S. gallinarum、S. pasteuri、S. sciuri和S. haemolyticus（見圖1中A）。其中，S. gallinarum是豐度最高的物種，占所分離Staphylococcus屬的70.6%，其他Staphylococcus菌株的豐度占比遠低于S. gallinarum，分別為S. sciuri（17.6%）、S. pasteuri（5.9%）、S. haemolyticus（5.9%）。菌株CDJ-1、CDJ-11、CDJ-17和CDJ-21與S. gallinarum SSB39、S. sciuri Zlynn 1000-43、S. pasteuri HN-35、S. haemolyticus SHKS1的同源性分別達到99.72%、99.86%、100%和100%，被篩選用作后續(xù)研究，其菌落形態(tài)與系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

2.3"葡萄球菌的生長情況與環(huán)境耐受性

2.3.1"生長曲線

揭示不同Staphylococcus菌株的生產(chǎn)情況和環(huán)境耐受性有助于深入了解其在甜瓣子發(fā)酵過程中的形成因素和驅(qū)動特性。4株葡萄球菌的生長曲線見圖2，其生長趨勢相似，在前8 h處于生長滯留期，隨后生物活力增強，在8～48 h內(nèi)呈指數(shù)增長，在48 h后生長變得緩慢，逐漸進入穩(wěn)定期。此外，S. gallinarum表現(xiàn)出最快的生長速度，在60 h時OD_{600 nm}值達到峰值2.32±0.03，其次分別為S. sciuri（2.11±0.03）、S. haemolyticus（2.11±0.01），而S. pasteuri增殖速度最慢（1.98±0.01）。

2.3.2"Staphylococcus菌株的耐酸性

在郫縣豆瓣釀造過程中，甜瓣子發(fā)酵在弱酸性（pH 6.5～4.5）環(huán)境中進行^[4]，pH勢必會影響葡萄球菌的生長代謝，從而影響終產(chǎn)品的品質(zhì)。因此，本研究考察了不同Staphylococcus菌株的酸耐受能力，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在12%鹽濃度下，4株Staphylococcus菌株均在pH 6.5時表現(xiàn)最適生長，S. gallinarum同樣展現(xiàn)出最優(yōu)的生長性能（OD_{600 nm}=1.57±0.01），顯著高于S. haemolyticus（1.45±0.03）、S. sciuri（1.38±0.01）和S.pasteuri（1.37±0.01）。隨著pH的下降，Staphylococcus菌株在低pH環(huán)境下的生長被顯著抑制，且在pH 4.5時未觀測到生長，這可能是在甜瓣子發(fā)酵后期樣品中分離不出葡萄球菌的原因^[1]。

2.3.3"Staphylococcus菌株的耐鹽性

食鹽是郫縣豆瓣發(fā)酵的重要輔料，其所形成的高滲透脅迫對Staphylococcus菌株的適應(yīng)和分布起著重要作用^[11]。Staphylococcus菌株的耐鹽特性見圖4。

由圖4可知，4種葡萄球菌均受到高鹽度的抑制，生長量隨著鹽濃度的增大而降低，但它們在16%鹽濃度下均可以良好生長，且在20%鹽濃度下也能保持一定的生長，說明4株葡萄球菌均具有較強的耐鹽性，與李雄波等^[21]的研究結(jié)果一致。此外，在各鹽濃度下，S. gallinarum均具有最理想的增殖情況，表明其耐鹽性明顯優(yōu)于其余3株葡萄球菌。

2.4"Staphylococcus gallinarum與優(yōu)勢背景微生物的相互作用

B.licheniformis、B. amyloliquefaciens、T. halophilus、Z. rouxii和C. etchellsii是甜瓣子發(fā)酵階段的內(nèi)源性優(yōu)勢微生物，利用模擬液體培養(yǎng)基探索了這些優(yōu)勢微生物與S. gallinarum菌株的相互作用關(guān)系，見圖5。

結(jié)果表明，當與這些優(yōu)勢內(nèi)源性微生物共培養(yǎng)時，S. gallinarum會受到不同的影響（見圖5中A）。其中，B. amyloliquefaciens和T. halophilus可顯著促進其生長（Plt;0.05），B. licheniformis和Z. rouxii則會顯著抑制其生長，而C. etchellsii對S. gallinarum的生長無明顯作用。反之，當與S. gallinarum共培養(yǎng)時，B. amyloliquefaciens、B. licheniformis和Z. rouxii的生長也會受到顯著的抑制（Plt;0.001），而T. halophilus和C. etchellsii的影響不顯著（見圖5中B）。上述結(jié)果表明，S. gallinarum與B. licheniformis和Z. rouxii的生長可能存在競爭關(guān)系，與B. amyloliquefaciens可能存在侵害關(guān)系，與T. halophilus可能存在偏利共生關(guān)系，而與C. etchellsii可能保持中性生長的關(guān)系。

3"結(jié)論

本文從蠶豆醬醅中共分離純化并鑒定出4種葡萄球菌，分別是S.gallinarum、S.pasteuri、S.sciuri和S.haemolyticus，其中，S.gallinarum的豐度最高。4株葡萄球菌均有較強的耐酸、耐鹽能力，其中，S. gallinarum在酸脅迫和鹽脅迫下的生長表現(xiàn)優(yōu)于其余3株葡萄球菌。S.gallinarum與豆瓣醬中其他優(yōu)勢微生物的相互作用結(jié)果表明，其與B. licheniformis和Z. rouxii的生長相互抑制，存在競爭關(guān)系，與B.amyloliquefaciens具有侵害關(guān)系，與T.halophilus具有偏利共生關(guān)系，與C.etchellsii保持中性生長關(guān)系。該研究結(jié)果可為揭示親緣關(guān)系密切的Staphylococcus菌株在郫縣豆瓣發(fā)酵過程中的生態(tài)分布提供一定指導(dǎo)。

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