摘 要：上游開放閱讀框（uORF）作為真核生物基因5′非翻譯區(qū)（5′-UTR）的重要組成部分，近年來因其在基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用而備受關(guān)注。但是，目前在魚類中對uORF的研究相對匱乏。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，針對斑馬魚生長激素受體（ghr）基因中的uORF進(jìn)行敲除，以探究uORF去除后對ghr表達(dá)及斑馬魚生長發(fā)育的影響。通過構(gòu)建ghr-uORF缺失的斑馬魚模型，我們發(fā)現(xiàn)敲除uORF后，ghr基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，且突變體斑馬魚在生長后期表現(xiàn)出生長優(yōu)勢。此外，突變體斑馬魚的肌肉組織發(fā)育也發(fā)生了變化，肌纖維形態(tài)接近圓形，排列較為緊密。這些結(jié)果表明，uORF在調(diào)控ghr基因表達(dá)中發(fā)揮了抑制作用，且敲除uORF可能促進(jìn)斑馬魚的生長和肌肉發(fā)育。本研究為理解uORF在動物中的調(diào)控機(jī)制提供了新的視角，并為魚類遺傳改良提供了新的策略。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；生長激素受體基因；上游開放閱讀框；基因編輯；生長發(fā)育

中圖分類號：Q78 " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A " " DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2025.01.005

Abstract： The upstream open reading frame （uORF） as an important component of the 5′ untranslated region （5′-UTR） of eukaryotic genes， has attracted much attention in recent years due to its significant role in gene expression regulation. However， research on uORF in fish is relatively scarce at present. In this study， using CRISPR/Cas9 gene editing technology， we targeted and knocked out the uORF in the zebrafish growth hormone receptor gene （ghr） to explore the impact of uORF removal on ghr expression and zebrafish growth and development. By constructing a zebrafish model with a ghr-uORF deletion， we found that after knocking out the uORF， the mRNA and protein expression levels of the ghr gene increased， and the mutant zebrafish showed a growth advantage at the later stages of growth. In addition， the muscle tissue development of the mutant zebrafish also changed， with muscle fiber morphology becoming more circular and arrangement being tighter. These results indicate that uORF plays a suppressive role in regulating ghr gene expression， and knocking out uORF may promote the growth and muscle development of zebrafish. This study provides a new perspective for understanding the regulatory mechanism of uORF in animals and offers a new strategy for genetic improvement in fish.

在生命活動過程中，基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控是維持細(xì)胞功能和生物體正常發(fā)育的關(guān)鍵。上游開放閱讀框（upstream open reading frame，uORF）作為真核基因5′非翻譯區(qū)（5′-UTR）的重要組成部分，近年來因其在基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用而備受關(guān)注［1-2］。uORF通過影響翻譯起始復(fù)合物的形成、核糖體掃描過程，進(jìn)而調(diào)控下游主開放閱讀框（major open reading frame，mORF）的翻譯效率［3-5］。隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，uORF編輯已成為一種重要的基因表達(dá)調(diào)控手段，為作物改良和生物技術(shù)應(yīng)用提供了新的策略和方法。

自uORF在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)以來，關(guān)于其調(diào)控作用的研究已擴(kuò)展至多個物種，包括植物和動物［6-10］。早期研究揭示了uORF長度對mORF翻譯效率的影響，即uORF越長，mORF的翻譯效率越低［6］。隨后的研究進(jìn)一步表明，uORF的起始密碼子和終止密碼子的特性及其在5′-UTR中的位置都深刻影響著其調(diào)控效能［3， 11］。近年來，隨著高通量測序技術(shù)和核糖體分析技術(shù)的發(fā)展，人們對uORF的了解更加深入。Chew等［12］通過對人類、小鼠和斑馬魚轉(zhuǎn)錄組的綜合分析，證明了uORF在調(diào)控基因表達(dá)中的普遍性和多樣性。然而，盡管已有研究指出uORF在植物中的調(diào)控作用，并嘗試通過基因編輯技術(shù)調(diào)整uORF的功能以改善作物性狀［13-14］，但在動物模型中，尤其是魚類中，對uORF的研究相對匱乏。鑒于魚類在經(jīng)濟(jì)和科學(xué)研究中的重要地位，填補(bǔ)這一研究空白顯得尤為必要。

斑馬魚生長激素受體（growth hormone receptor，ghr）基因在調(diào)控生長和代謝方面發(fā)揮著核心作用［15］。盡管斑馬魚ghr的相關(guān)研究取得了一定的進(jìn)展，但關(guān)于uORF在ghr基因表達(dá)調(diào)控中的具體作用及其分子機(jī)制尚不清楚。此外，斑馬魚的繁殖周期短、體外受精和發(fā)育的特性，也為遺傳操作和功能研究提供了便利。通過編輯ghr基因中的uORF，我們可以更深入地理解uORF在動物生長發(fā)育中的作用，同時為魚類遺傳改良提供新的策略。

本研究旨在利用CRISPR/Cas9技術(shù)，針對ghr中的uORF進(jìn)行編輯，探究uORF去除后對ghr表達(dá)及斑馬魚生長發(fā)育的影響，從而為魚類遺傳改良提供新的理論依據(jù)和技術(shù)手段。為此，首先，我們構(gòu)建了ghr-uORF缺失的斑馬魚模型，然后，通過一系列生理和分子生物學(xué)試驗，分析了uORF缺失對斑馬魚生長發(fā)育的影響。本研究不僅為理解uORF在動物中的調(diào)控機(jī)制提供了新的視角，也為魚類育種和生物技術(shù)的應(yīng)用開辟了新的可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

斑馬魚（Danio rerio，AB品系）來自湖南師范大學(xué)省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點實驗室。

1.1.2 試驗試劑和儀器

本研究選用了DNA提取試劑盒（美國歐米伽生物技術(shù)公司）、RNA提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）、Pro Taq Master Mix（湖南艾科瑞生物工程有限公司）、SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）和T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），以及Q5實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析儀（美國賽默飛世爾科技公司）、5424R冷凍離心機(jī)（德國艾本德股份公司）和Mastercycler Nexus PCR儀（德國艾本德股份公司）等精密儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 ghr基因uORF可突變位點篩選和gRNA設(shè)計

序列獲?。簭腘CBI下載斑馬魚ghr基因第一外顯子上游約1 000 bp的序列，使用ORFfinder檢索uORF序列。

gRNA設(shè)計：使用Snapgene分析uORF序列，選擇uORF起始密碼子附近的序列作為CRISPR/Cas9靶位點。根據(jù)20 bp + nGG原則篩選gRNA位點，如表1所示。

靶位點驗證：在Ensembl數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對（網(wǎng)址為http：//asia.ensembl.org/Danio rerio/Tools/Blast），預(yù)測脫靶情況。

寡核苷酸鏈（oligonucleotide，oligo）設(shè)計：根據(jù)靶位點設(shè)計互補(bǔ)的oligo序列，并在正向鏈上添加酶切位點。將oligo片段交由生物公司合成。

1.2.2 顯微注射

混合gRNA與Cas9蛋白：將gRNA（200～ 300 ng/μL）與Cas9蛋白（20 ng/μL）混合，最終配制成20 μL的注射樣品，冰上孵育30 min。

斑馬魚準(zhǔn)備：挑選可育斑馬魚親本，顯微注射前一晚停食3 h，按雌魚比雄魚1：2或1：3的比例放入繁殖缸中，水溫28℃，用隔板隔開，黑暗環(huán)境10 h。第2天換水并給予光照刺激，30 min后取出隔板，收集胚胎。

顯微注射：將吸水膨脹后的胚胎排列在瓊脂糖凝膠培養(yǎng)皿中，用移液槍將注射樣品轉(zhuǎn)移到顯微注射針中，調(diào)整顯微注射儀確保樣品緩慢流出。注射時選擇一細(xì)胞期的胚胎，并盡量注射于胚胎的動物極。

注射后處理：注射完成后，將胚胎放置在新的培養(yǎng)皿中，加入干凈的水，靜置20 min后轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。選取未注射的同期胚胎作為對照組，保持相同的培養(yǎng)條件。受精后12 h（12 hours post-fertilization，12 hpf）和24 hpf更換水并去除死亡胚胎，之后每天至少更換1次水。

1.2.3 突變位點篩選及純合子選育

DNA提取與PCR擴(kuò)增：注射后24 h，分別選取注射后的胚胎和對照組胚胎各20個，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3遍后，使用DNA提取試劑盒提取DNA，作為PCR反應(yīng)模板。PCR引物序列如表2所示。

PCR產(chǎn)物處理與測序：將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的條帶，連接到18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂平板后過夜培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測，挑取陽性單克隆菌液送至公司測序。

突變位點分析：使用BioEdit和SnapGene軟件分析測序結(jié)果，選擇gRNA2作為引導(dǎo)鏈進(jìn)行基因編輯試驗。將顯微注射后的斑馬魚飼養(yǎng)至性成熟，每條斑馬魚單獨(dú)剪尾鰭提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，篩選出成功編輯的斑馬魚。

純合子選育：將成功編輯的斑馬魚與普通AB斑馬魚雜交，產(chǎn)出F1代飼養(yǎng)至性成熟。將F1代斑馬魚每條單獨(dú)剪尾鰭提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，篩選出雜合子斑馬魚。選擇基因型相同的雜合子斑馬魚進(jìn)行自交，產(chǎn)出F2代飼養(yǎng)至性成熟，每條斑馬魚單獨(dú)剪尾鰭提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，篩選出純合子個體。

1.2.4 qRT-PCR

樣本準(zhǔn)備：將突變體純合子斑馬魚和對照斑馬魚分別放入繁殖缸中，公魚和母魚用隔板隔開，避光處理一晚上。第2天光照刺激15 min后拔掉隔板，收集胚胎。在不同發(fā)育階段，分別吸取20～30顆胚胎放于1.5 mL EP管中，用PBS清洗3次后放入液氮中冷凍，保存于-80℃冰箱中。

RNA提取：使用RNA提取試劑盒提取RNA，詳細(xì)操作步驟見試劑盒說明書。RNA提取成功后用瓊脂糖凝膠電泳法檢測其質(zhì)量濃度。

cDNA合成：使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)RNA質(zhì)量濃度計算加入模板的量，使模板定量為1 μg。

引物設(shè)計與qRT-PCR：在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取斑馬魚ghr基因的編碼序列（coding sequence，CDS），使用Oligo 7軟件設(shè)計特異性引物，篩選出合適的目的片段引物。β-actin作為內(nèi)參引物。使用qRT-PCR分析儀進(jìn)行檢測。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot，WB）

蛋白提取與定量：使用蛋白提取試劑盒提取斑馬魚胚胎蛋白，具體步驟見試劑盒說明書。使用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA）測定蛋白質(zhì)量濃度。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：使用PAGE凝膠快速制備試劑盒配置聚丙烯酰胺凝膠，具體配置方法見試劑盒說明書。電泳時每個泳道加樣30 μL，電流20 mA，根據(jù)指示劑溴酚藍(lán)位置確定結(jié)束時間。

WB：具體方法見試劑盒說明書。

1.2.6 冰凍切片

樣本準(zhǔn)備：取性成熟突變體純合子斑馬魚和對照組斑馬魚，剪取尾部，撕去皮膚，用PBS清洗，包埋于最佳切割溫度包埋劑（optimal cutting temperature，OCT）中，放入液氮中冷凍。

切片：提前將冰凍切片機(jī)降溫，將預(yù)處理好的肌肉組織放入機(jī)箱內(nèi)，調(diào)整好防卷板的位置和切片厚度，用載玻片吸附切好的切片，置于顯微鏡下拍照觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 ghr基因uORF的編輯體系的構(gòu)建及突變體的篩選

通過將合成的靶位點序列與經(jīng)BsaI酶切后的線性化PDR274質(zhì)粒載體進(jìn)行重組，成功構(gòu)建了用于基因編輯的重組質(zhì)粒（圖1a）。使用重組質(zhì)粒上的常見酶切位點序列設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增獲得了包含靶位點及T7啟動子附近區(qū)域的片段，該片段隨后用作體外轉(zhuǎn)錄的模板（圖1b）。從體外轉(zhuǎn)錄模板的T7啟動子區(qū)域開始，我們進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄過程，最終獲得了目標(biāo)gRNA（圖1c）。

獲得gRNA后，我們將ghr基因uORF的5個gRNA分別與Cas9蛋白混合，并注射入斑馬魚胚胎中。每個gRNA進(jìn)行了3次獨(dú)立的注射試驗，每次注射約300個胚胎。注射后，將斑馬魚胚胎飼養(yǎng)至性成熟階段，通過剪取尾鰭提取DNA并進(jìn)行測序，統(tǒng)計突變率（表3）。結(jié)果顯示，大多數(shù)突變涉及單個或少數(shù)幾個核苷酸的替換，而ghr基因uORF的gRNA2靶位點則出現(xiàn)了基因缺失現(xiàn)象。因此，選擇這個靶位點對應(yīng)的gRNA進(jìn)行后續(xù)的基因編輯試驗。將編輯成功的突變體作為親本，與普通AB斑馬魚雜交產(chǎn)生F1代，再從F1代中篩選出具有相同基因型的個體進(jìn)行自交，從而獲得F2代純合子突變體。通過比較ghr-uORF突變體斑馬魚及對照組野生型（wild type，WT）斑馬魚的基因測序結(jié)果（圖1d），發(fā)現(xiàn)ghr-uORF突變體斑馬魚缺失了4個堿基序列。

2.2 ghr-uORF-/-斑馬魚mRNA水平表達(dá)

利用qRT-PCR技術(shù)，我們對突變體純合子斑馬魚胚胎和普通斑馬魚胚胎在不同發(fā)育階段的ghr基因表達(dá)水平進(jìn)行了定量分析。如圖2所示：隨著胚胎的發(fā)育，兩組斑馬魚的ghr基因表達(dá)量均呈上升趨勢；然而，在所有檢測的時間點上，突變體斑馬魚的ghr基因表達(dá)量均顯著高于對照組，且表達(dá)增長率也更高。

2.3 ghr-uORF-/-斑馬魚蛋白水平表達(dá)

通過提取不同發(fā)育階段的突變體純合子斑馬魚胚胎和對照組斑馬魚胚胎的蛋白樣本，使用SDS-PAGE凝膠電泳和WB技術(shù)檢測了ghr基因的蛋白表達(dá)情況。如圖3所示：隨著斑馬魚胚胎的發(fā)育，ghr基因的蛋白表達(dá)量逐漸增加；此外，突變體斑馬魚在所有檢測時間點上的ghr基因蛋白表達(dá)量均顯著高于對照組，尤其是在肌效期之后，突變體斑馬魚的ghr基因蛋白表達(dá)增長更為明顯。

2.4 ghr-uORF-/-斑馬魚表型及肌肉生長情況觀察

為了進(jìn)一步了解ghr-uORF突變對斑馬魚生長的影響，我們在斑馬魚生長的不同階段：受精后5 d（5 days post-fertilization，5 dpf）、20 dpf、30 dpf、50 dpf和120 dpf記錄了對照組斑馬魚和ghr-uORF突變體純合子斑馬魚的生長狀況，并測量了它們的體長和體高（圖4a～4c，表4）。結(jié)果表明：在早期生長階段（5 dpf和20 dpf），兩組斑馬魚在體長和體高方面沒有顯著差異；然而，到30 dpf、50 dpf和120 dpf時，ghr-uORF突變體斑馬魚的體長和體高均顯著大于對照組斑馬魚。

對ghr-uORF突變體斑馬魚和對照組斑馬魚的尾部肌肉組織進(jìn)行了冰凍切片分析，以評估肌肉組織的發(fā)育情況。對照組AB斑馬魚的肌纖維多呈現(xiàn)為多角形或橢圓形，排列緊密，直徑大小不一；相比之下，ghr-uORF突變體斑馬魚的肌纖維短徑變長，長徑變短，形態(tài)接近圓形，排列也較為緊密。統(tǒng)計結(jié)果顯示，ghr-uORF突變體斑馬魚的肌纖維面積并未發(fā)生顯著變化，但密度有增大（圖4d～4e）。

3 討論

在本研究中，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了斑馬魚ghr-uORF敲除突變體，并對其生長和肌肉發(fā)育進(jìn)行了表型分析。通過qRT-PCR和WB技術(shù)，發(fā)現(xiàn)敲除ghr基因的uORF后，其mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著提高，表明uORF在調(diào)控ghr基因表達(dá)中發(fā)揮了抑制作用。此外，觀察到突變體斑馬魚在生長后期（30 dpf、50 dpf和120 dpf）的體長和體高顯著大于對照組，這表明uORF的敲除可能促進(jìn)了斑馬魚的生長。

ghr基因在魚類中扮演著至關(guān)重要的角色，主要涉及生長激素（growth hormone，GH）的信號傳導(dǎo)［16-18］。ghr基因編碼的生長激素受體是細(xì)胞因子受體超家族的成員之一，通過與GH結(jié)合，激活下游的信號傳導(dǎo)途徑，包括Janus蛋白酪氨酸激酶2（janus tyrosine-protein kinase 2，JAK2）、信號傳遞及激活轉(zhuǎn)錄因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）等，從而調(diào)節(jié)魚類的生長和發(fā)育［19］。ghr基因在調(diào)控魚類生長速率方面具有重要作用，例如，建鯉ghr基因多態(tài)性的研究顯示，ghr基因的變異與增重顯著相關(guān)。通過聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法檢測了建鯉ghr基因多個SNP位點，并分析了不同基因型與生長性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明，某些ghr基因的SNP位點與體重、體高、體長、尾柄高和尾柄長等生長性狀顯著相關(guān)［20］。這些研究結(jié)果為理解ghr基因在魚類生長中的作用提供了直接證據(jù)，并為分子標(biāo)記輔助育種提供了潛在的靶點。

uORF在真核生物基因表達(dá)調(diào)控中扮演著重要角色［2， 21-22］。近年來的研究進(jìn)展表明，uORF通過影響翻譯起始復(fù)合物的形成和核糖體掃描過程，進(jìn)而調(diào)控mORF的翻譯效率［3， 23］。隨著基因編輯技術(shù)，特別是CRISPR/Cas9技術(shù)的快速發(fā)展，uORF編輯已成為研究和調(diào)控基因表達(dá)的有效手段。在植物中，uORF的調(diào)控作用已被廣泛研究，其在生長發(fā)育、逆境響應(yīng)和激素信號傳導(dǎo)等方面的作用不斷被闡明［14］。通過基因編輯技術(shù)調(diào)整uORF的功能，可以改善作物性狀和逆境耐受性。例如，Zhang等［13］利用CRISPR/Cas9技術(shù)對植物基因的uORF進(jìn)行編輯，顯著提高了目標(biāo)基因的翻譯效率，并建立了調(diào)控內(nèi)源基因蛋白質(zhì)翻譯效率的新方法。此外，通過編輯uORF，能夠成功培育出維生素C含量顯著提高的生菜種質(zhì)，以及對果實糖分含量進(jìn)行梯度調(diào)控的草莓品種［24］。在本研究中，我們觀察到斑馬魚ghr-uORF敲除后，ghr基因的表達(dá)水平顯著提高，這可能與uORF的翻譯抑制作用被解除有關(guān)。并且，斑馬魚ghr-uORF敲除突變體在生長后期表現(xiàn)出生長優(yōu)勢。這可能與ghr基因表達(dá)水平的提高有關(guān)，因為ghr是生長激素信號通路的關(guān)鍵組分，其表達(dá)水平的增加可以促進(jìn)生長激素的信號傳導(dǎo)，從而促進(jìn)生長［25］。此外，我們觀察到突變體斑馬魚的肌肉組織發(fā)育也發(fā)生了變化，肌纖維短徑變長，形態(tài)接近圓形，排列較為緊密，這可能與ghr基因表達(dá)的提高有關(guān)，因為ghr信號通路在肌肉發(fā)育中起著重要作用［15］。然而，我們并未觀察到肌纖維面積和密度的顯著變化，這可能表明uORF敲除對肌肉組織的發(fā)育有一定的影響，但這種影響可能受到其他因素的調(diào)節(jié)。

盡管本研究提供了uORF在斑馬魚ghr基因表達(dá)調(diào)控中的作用的證據(jù)，但仍存在一些局限性。首先，本研究主要集中在ghr基因的表達(dá)和肌肉組織發(fā)育上，未來研究可以進(jìn)一步探索uORF敲除對斑馬魚其他生理過程的影響，如脂肪代謝、骨骼發(fā)育等。其次，本試驗主要關(guān)注了uORF敲除對斑馬魚生長后期的影響，未來研究可以探索uORF敲除對早期發(fā)育階段的影響。最后，雖然我們觀察到了ghr-uORF敲除突變體的生長優(yōu)勢，但這種優(yōu)勢的具體機(jī)制尚不清楚，未來研究可以利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，深入探索uORF敲除對斑馬魚生長調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響。

總之，本研究揭示了uORF在斑馬魚ghr基因表達(dá)調(diào)控中的作用，并為理解uORF在魚類生長和發(fā)育中的功能提供了新的視角。這些發(fā)現(xiàn)不僅為魚類生物學(xué)研究提供了重要的基礎(chǔ)信息，也為魚類育種和生物技術(shù)的應(yīng)用提供了新的思路。

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收稿日期：2024-11-05；修回日期：2024-12-15。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（32072959）。

作者簡介：#并列第一作者。王海濤，碩士研究生；劉純潔，碩士研究生。

*通信作者：彭亮躍，副教授，主要從事水生經(jīng)濟(jì)動物研究。E-mail： ply@hunnu.edu.cn。