欽　斌　蔡建平

[摘要] 隨著細(xì)胞研究的發(fā)展，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用越來越受到重視。本文對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性、取材、分離、培養(yǎng)、臨床前期研究成果和面臨的問題進(jìn)行了綜述。

[關(guān)鍵詞] 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；生物學(xué)特性；取材；分離；培養(yǎng)；臨床應(yīng)用

[中圖分類號] R329.2[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1673-7210（2009）02（a）-011－０2

1867年，Cohnheim首先提出了骨髓內(nèi)含有骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的觀點；而Frieden-stein于1966年首先發(fā)現(xiàn)，它是骨髓基質(zhì)的組成成分，能分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。骨髓是由造血干細(xì)胞和非造血干細(xì)胞組成的器官，非造血干細(xì)胞（即MSCs）由骨前體細(xì)胞、軟骨前體細(xì)胞、脂肪前體細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和肌細(xì)胞前體細(xì)胞組成，因此，MSCs是由骨髓組織干細(xì)胞或前體細(xì)胞和軀體組織干細(xì)胞組成的成分及功能復(fù)雜的細(xì)胞群體[1]。許多年來，MSCs基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的前期研究取得了重大進(jìn)展，但是仍有許多問題尚待解決。

1細(xì)胞形態(tài)

MSCs具有3種細(xì)胞形態(tài)：①梭形細(xì)胞；②巨大扁平細(xì)胞；③體積非常小的球形細(xì)胞[2]。

2生物學(xué)特性

MSCs有以下生物學(xué)特性：①自我更新能力。MSCs在體內(nèi)具有很強(qiáng)的自我更新能力，是傳代細(xì)胞[3]。②很強(qiáng)的黏附性。體外培養(yǎng)收集細(xì)胞時MSCs容易與骨髓基質(zhì)分離形成細(xì)胞懸液，體外低密度培養(yǎng)時MSCs迅速黏附，反復(fù)沖洗可與非黏附的造血干細(xì)胞分離[2]。③可塑性。MSCs具有可塑性，即具有多向分化的潛能。骨髓脂肪細(xì)胞株在體內(nèi)可分化為真正的骨組織[4]，骨髓網(wǎng)狀細(xì)胞在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)橹炯?xì)胞。在適宜的微環(huán)境下，MSCs可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、星形細(xì)胞、少突樹突細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等，而且能跨胚層分化，屬于不同胚層的MSCs或前體細(xì)胞還能分化成與本身組織不相關(guān)的其他胚層組織，如骨髓中存在成肌細(xì)胞前體細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞能重新分化成造血細(xì)胞，骨髓細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞[5-7]。④快速增殖形成克隆的能力。MSCs能迅速產(chǎn)生單細(xì)胞源克隆，而且這些克隆均來源于單細(xì)胞克隆-克隆形成單位成纖維細(xì)胞（CFU-F）[5-7]。⑤可移植性。MSCs具有自我更新能力和可塑性，因此具備了可以移植的前提條件。一些臨床前期研究表明MSCs移植可治療某些疾病。

3生物學(xué)特性的改變

MSCs在體內(nèi)骨髓微環(huán)境下生長并保持特有的生物學(xué)特性，但經(jīng)體外適宜環(huán)境條件下培養(yǎng)后，許多生物學(xué)特性發(fā)生改變。①“歸巢”能力喪失。大多數(shù)研究表明，原代MSCs體外培養(yǎng)并輸注移植后，在受體中不能檢測到或只能部分檢測到供體的MSCs[8]。②分化潛能喪失。MSCs體外培養(yǎng)后，有的失去分化成脂肪細(xì)胞的能力，有的失去分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的能力[9，10]。③細(xì)胞形態(tài)異質(zhì)性喪失。原代MSCs具有細(xì)胞形態(tài)的異質(zhì)性，但經(jīng)過一定時間的體外培養(yǎng)（傳代3次），形態(tài)的異質(zhì)性逐漸喪失，細(xì)胞形態(tài)主要為巨大扁平細(xì)胞[11]。④細(xì)胞融合入或核融合。當(dāng)人MSCs與熱休克損傷的上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)時，部分細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成上皮細(xì)胞而與其他細(xì)胞或上皮細(xì)胞融合變成雙核細(xì)胞且表達(dá)上皮細(xì)胞表面抗原[12]。細(xì)胞融合入或核融合的機(jī)制和生物學(xué)意義目前尚未明確。

4細(xì)胞的采集和培養(yǎng)

MSCs的取材一般采用骨髓穿刺法，操作方便，創(chuàng)傷小，可反復(fù)取材而不影響細(xì)胞活力及機(jī)體功能。分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞的方法主要有三種：貼壁篩選法、密度梯度離心法和流式細(xì)胞分選術(shù)（flow cytometer，F(xiàn)CM）。貼壁篩選法經(jīng)濟(jì)方便但純化程度有限，有待進(jìn)一步改進(jìn)。密度梯度離心法得到的細(xì)胞純度可達(dá)95%[13]。流式細(xì)胞分選術(shù)可根據(jù)MSCs與造血細(xì)胞的表面標(biāo)記的不同，用帶有熒光標(biāo)記的抗體從混合細(xì)胞群中獲取高純度的MSCs。BioWhittaker Inc.用表面分子CD105、CD166、CD29、CD44陽性和CD14、CD34、CD45陰性篩選法得到幾乎完全純化的MSCs[14]。

靜態(tài)單層培養(yǎng)法是目前較為經(jīng)典的細(xì)胞培養(yǎng)方法。這種方法簡便易操作，成本低廉；缺點是培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量受培養(yǎng)器皿底面積限制，且不符合體內(nèi)的生理環(huán)境。隨著骨組織工程的研究，構(gòu)建功能性組織工程骨已成為理想目標(biāo)，進(jìn)而對種子細(xì)胞的培養(yǎng)提出了更高的要求。生物反應(yīng)器的使用使得MSCs的體外動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境更接近于體內(nèi)，從而使種子細(xì)胞功能形狀等各方面更加完善。有研究表明，運用灌流式生物反應(yīng)器不但可以進(jìn)行多組織培養(yǎng)，而且還可以獲得4.22×107/ml的細(xì)胞密度，長時間培養(yǎng)仍能保持細(xì)胞的多分化特性[15]。

MSCs體外培養(yǎng)需要種子數(shù)量較大，使用常規(guī)的培養(yǎng)方法往往需要長時間培養(yǎng)、多次傳代才能完成。微載體培養(yǎng)法[16]在這一方面具有顯著的優(yōu)點：①兼有單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點，且是均相培養(yǎng)；②細(xì)胞所處的培養(yǎng)環(huán)境均一；③培養(yǎng)條件（溫度、pH值、CO2等）容易調(diào)節(jié)和監(jiān)控；④具有較高的比表面積，培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量更多；⑤培養(yǎng)操作可系統(tǒng)化、自動化，減少了發(fā)生污染的機(jī)會。

5臨床應(yīng)用

MSCs具有可塑性和可移植性，因此它與骨髓造血干細(xì)胞一樣，具有重要的臨床治療價值。如何應(yīng)用MSCs進(jìn)行臨床治療是目前研究的熱點。目前常用的應(yīng)用方法有：①作為轉(zhuǎn)基因靶細(xì)胞。用腺病毒把目的基因轉(zhuǎn)入MSCs，然后再把它們移植到相關(guān)的受損組織或器官。②MSCs體外擴(kuò)增后靜脈輸注移植[17]。③MSCs局部移植。MSCs局部注射到關(guān)節(jié)腔可刺激軟骨細(xì)胞再生，延緩關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞；注射到冠狀動脈可使心臟缺血區(qū)心肌細(xì)胞再生；注射到腦缺血壞死灶區(qū)能誘導(dǎo)新的神經(jīng)細(xì)胞再生。MSCs作為種子細(xì)胞具有廣泛的臨床治療譜。

基礎(chǔ)研究和臨床研究表明，MSCs具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，但臨床應(yīng)用還有很多需要逾越的障礙。MSCs體外培養(yǎng)后細(xì)胞會衰老，增殖能力下降[18]；MSCs體外培養(yǎng)時會喪失部分或大部分多向分化的能力[9，10]，出現(xiàn)這種機(jī)制的原因不明，也沒有解決辦法。體外培養(yǎng)時MSCs喪失“歸巢”能力，不能到達(dá)髓或脾臟等目的器官[19]。動物模型研究表明，輸注移植骨髓前體細(xì)胞在受體體內(nèi)只能獲得有限的移植細(xì)胞，成肌細(xì)胞及其他細(xì)胞通過全是循環(huán)后到達(dá)肌肉組織的，細(xì)胞數(shù)量有限。目前的前期臨床研究表明，雖然少量供體的MSCs能在受體體內(nèi)存活，但大量證據(jù)表明MSCs不能通過全身輸注來移植[20]。

MSCs的研究已經(jīng)歷了30多年，對它的生物學(xué)特性也有了相當(dāng)?shù)牧私?，許多前期臨床研究展現(xiàn)了廣泛而誘人的臨床治療前景。國內(nèi)外對自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)與臨床研究，主要集中于細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增后再植入體內(nèi)方面，但是存在著患者等待治療時間長、所需治療費用昂貴以及倫理學(xué)要求等諸多不足，因而嚴(yán)重限制了其在臨床上的應(yīng)用與推廣。目前應(yīng)用自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞通過濃集技術(shù)（提高骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的濃度）再與骨形態(tài)生長蛋白（BMP）、自體骨及多孔生物陶瓷材料復(fù)合，然后種植于機(jī)體內(nèi)使其成骨，治療骨缺損等疾病，將會成為研究熱點。

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（收稿日期：2009-01-07）