孫文秀 朱小慧

（長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州，434025）

辣椒疫霉菌對(duì)不同辣椒品種抗病性相關(guān)酶活性的影響

孫文秀 朱小慧

（長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州，434025）

對(duì)優(yōu)質(zhì)抗辣椒疫病品種海豐Zt-277、特大湯椒二號(hào)F1和感辣椒疫病品種天驕2號(hào)進(jìn)行辣椒疫霉菌接種，測(cè)定了辣椒葉片中與抗病性相關(guān)的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的活性和丙二醛（MDA）的含量變化，結(jié)果表明，接種與未接種相比，抗病品種葉片中SOD，POD活性提高幅度要低于感病品種，MDA的含量提高幅度要高于感病品種。但不論辣椒疫霉菌接種與否，抗病品種辣椒葉片中SOD、POD活性高于感病品種；感病品種辣椒葉片中MDA含量高于抗病品種。

辣椒 抗病性 超氧化物歧化酶 過氧化物酶 丙二醛

辣椒疫病（Phytophthora capsiciLeon.）是一種世界性土傳病害，嚴(yán)重影響我國(guó)及世界各國(guó)的辣椒生產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。辣椒疫霉菌是一種土傳性寄生菌，存活時(shí)間長(zhǎng)，寄主范圍廣，致病變異強(qiáng)，菌株間存在明顯的致病分化現(xiàn)象，給有效地防治辣椒疫病帶來很大的困難。

植物在抵御病原微生物的侵染過程中，抗性相關(guān)酶發(fā)揮著重要作用，這主要包括酚類代謝系統(tǒng)中的一些酶和病原相關(guān)蛋白（PR蛋白）家族[1]。如過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（SOD）等是存在于植物體內(nèi)與抵抗病原微生物侵染有關(guān)的酶[2]。為從生理生化方面闡明植物的抗性機(jī)理，近年來，人們?cè)絹碓街匾曆芯恐参锏目共⌒耘c活性氧及細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)的關(guān)系，先后發(fā)現(xiàn)黃瓜、水稻、小麥、玉米、茭白等多種植物受到病原菌感染后，其體內(nèi)活性氧代謝及防御酶系的活性發(fā)生變化，并與植物的抗病性相關(guān)[3～7]。但國(guó)內(nèi)外學(xué)者就某些植物的抗病性與活性氧及其代謝酶的關(guān)系的研究中，試驗(yàn)結(jié)果不盡一致。

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)辣椒疫霉菌的分類、形態(tài)特征和發(fā)病癥狀有較為詳細(xì)的研究。本試驗(yàn)對(duì)不同抗性辣椒品種接種疫霉菌后葉片中抗病性相關(guān)酶的活性進(jìn)行測(cè)定，并分析其與抗病性的關(guān)系，以期為辣椒苗期抗疫病性早期鑒定和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣椒品種為經(jīng)抗病性鑒定的海豐Zt-277（高抗）（編號(hào)為1號(hào)）、特大湯椒二號(hào)F1（抗?。ň幪?hào)為2號(hào)）和天驕2號(hào)（感病）（編號(hào)為3號(hào)）。

供試菌種選用分離自湖北荊州辣椒田的致病力較強(qiáng)的辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici），編號(hào)為JZ-01。

試驗(yàn)所用試劑有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、磷酸緩沖液、甲硫氨酸、EDTA-Na2、核黃素、酶液、愈創(chuàng)木酚、10%三氯乙酸、0.6%硫代巴比妥酸。

1.2 試驗(yàn)方法

①辣椒疫霉菌接種 將供試?yán)苯芬呙咕鶭Z-01首先從試管中轉(zhuǎn)移至燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OMA）平板上，培養(yǎng)7 d后用Petri溶液培養(yǎng)3 d，于4℃冰箱中放置30 min誘發(fā)產(chǎn)生大量孢子囊并釋放游動(dòng)孢子，配制一定濃度的游動(dòng)孢子懸浮液作為接種體。辣椒種子用1%的次氯酸鈉液表面消毒1 min，自來水反復(fù)沖洗后，置28℃溫箱中黑暗保濕催芽，露白后，播入裝有滅菌土（120℃，2 h）的花盆中，生長(zhǎng)至5～6葉期用已配好的游動(dòng)孢子懸浮液進(jìn)行接種。

②酶活性的測(cè)定 辣椒疫霉菌接種后5 d取樣，剪取接種植株倒3葉葉片，去除葉脈后剪碎，取0.5 g置于預(yù)冷的研缽中，加1.0 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH值7.8）和少許聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為5 mL，于4℃，13 000 r/min下離心20 min，上清液即為酶液粗提液。以未接種植株倒3葉葉片為對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

表1 辣椒疫霉菌接種對(duì)不同辣椒品種SOD，POD活性和MDA含量的影響

a.超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定 參照陳志誼等[8]方法并稍作修改。在3 mL反應(yīng)體系中，加入0.05 mol/L磷酸緩沖液 1.5 mL，130 mmol/L甲硫氨酸 0.3 mL，750 μmol/L NBT 0.3 mL，100 μmol/L EDTA-Na20.3 mL，20 μmol/L核黃素0.3 mL，蒸餾水0.25 mL，酶液0.05 mL。以不加酶液為對(duì)照，混勻后于4 000 lx日光下反應(yīng)20 min（要求各管受光情況一致，溫度高時(shí)時(shí)間縮短，溫度低時(shí)時(shí)間延長(zhǎng)）。以抑制氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位，按下式計(jì)算SOD的活性：SOD總活性＝(ACK－AE)×V/(ACK×0.5× W×Vt)。

式中，ACK為對(duì)照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積 （mL）；Vt為測(cè)定時(shí)樣品用量（mL）；W為葉樣品鮮質(zhì)量（g）。SOD單位為U/g。

b.過氧化物酶（POD）活性的測(cè)定 POD活性測(cè)定參照李靖等[9]方法并加以改進(jìn)。

c.丙二醛（MDA）含量測(cè)定 參照趙世杰等[10]方法測(cè)定MDA含量。取上清液分別在450 nm，532 nm和600 nm處測(cè)定吸光度值OD450、OD532和OD600。按公式：C＝6.45（OD532－OD600）－0.56OD450求出樣品的MDA濃度，MDA含量＝MDA濃度×提取液體積／植物組織鮮質(zhì)量，MDA單位為μmol/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒疫霉菌接種對(duì)辣椒葉片SOD活性的影響

不同抗性辣椒品種接種辣椒疫霉菌后SOD活性有明顯差異（表1）。未接種辣椒疫霉菌時(shí)，對(duì)辣椒疫病抗性越強(qiáng)的辣椒葉片中SOD活性越高，海豐Zt－277葉片中SOD活性達(dá)402.38 U/g，而感病辣椒品種葉片中SOD活性為327.15 U/g。辣椒疫霉菌接種5 d后，供試?yán)苯啡~片中SOD的活性均有所提高，但提高的幅度因抗性的強(qiáng)弱而不同：海豐Zt－277提高幅度最小，僅有5.02%；特大湯椒二號(hào)F1葉片中SOD活性提高幅度較大；而感病品種天驕2號(hào)葉片中SOD活性提高率為21.52%。由此可以看出，SOD含量的高低與辣椒抗病性強(qiáng)弱有一定的關(guān)系。

2.2 辣椒疫霉菌接種對(duì)辣椒葉片POD活性的影響

由表1可知，不論接種辣椒疫霉菌與否，供試不同抗性的辣椒葉片中POD活性均較低，但接種辣椒疫霉菌5 d后，POD活性增幅較大。接種后高抗和抗病品種葉片中POD活性比接種前分別提高24.97%和23.66%；而感病品種天驕2號(hào)葉片中POD活性提高53.83%，上升劇烈。由此可以看出，接種辣椒疫霉菌后不同抗性的辣椒葉片中POD活性均有所升高，且感病品種POD活性提高幅度明顯高于高抗和抗病品種。

2.3 辣椒疫霉菌接種對(duì)辣椒葉片丙二醛（MDA）含量的影響

由表1可以看出，在無辣椒疫霉菌脅迫時(shí)，辣椒葉片中MDA含量普遍較低，且抗辣椒疫病的辣椒品種葉片中MDA含量比感辣椒疫病品種低，接種辣椒疫霉菌后植株體內(nèi)的MDA含量均高于未接種植株，且不同品種間MDA含量變化較大。高抗材料海豐Zt－277葉片中MDA含量大幅提高，達(dá)60%以上；而感病材料天驕2號(hào)葉片中MDA含量提高幅度明顯低于抗病品種，但抗病品種中MDA含量仍低于感病品種。

3 小結(jié)與討論

研究表明，植物在逆境脅迫或衰老過程中，其細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除的平衡會(huì)受到破壞，使一系列活性氧積累，傷害植物細(xì)胞膜系統(tǒng)，造成色素?fù)p失、膜透性擴(kuò)大、離子外滲，甚至導(dǎo)致植株死亡等。植物體內(nèi)廣泛存在能清除活性氧代謝的保護(hù)酶，其中SOD，POD和CAT是細(xì)胞抵御活性氧傷害的主要酶類，可以保護(hù)膜系統(tǒng)免受自由基的傷害，這3種酶與植物抗病性有重要關(guān)系。MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，它的積累是活性氧毒害作用的表現(xiàn)，可作為膜脂過氧化作用的一種指標(biāo)。

本試驗(yàn)中，不論接種辣椒疫霉菌與否，抗病品種辣椒葉片中SOD，POD活性高于感病品種，但接種疫霉菌后，抗病品種葉片中SOD，POD活性提高幅度要低于感病品種，這與馬海賓等[11]的研究結(jié)果基本一致。本研究表明感病品種辣椒葉片中MDA含量在接種辣椒疫霉菌前后均高于抗病品種，但抗病品種辣椒葉片中MDA含量提高幅度要高于感病品種。這表明海豐Zt－277抗病品種具有清除自由基和抗膜脂過氧化的作用，與該品種接種后辣椒疫病發(fā)病輕、抗性好是一致的。

植物中與抗病性相關(guān)的酶有多種，它們是相互協(xié)同而不是單獨(dú)起作用的[12]，不同植物甚至同種植物的不同種、不同脅迫因子等條件下酶活性的變化與抗病性也不相同，甚至相反。如在水稻白葉枯病的研究中，吳岳軒等[13]、曾富華等[14]、廖朝暉等[15]、肖用森等[16]發(fā)現(xiàn)水稻感染白葉枯病菌后葉片中 SOD，POD活性和MDA含量變化結(jié)果不一致。上述試驗(yàn)結(jié)果一方面可解釋不同植物病害系統(tǒng)，其抗病反應(yīng)過程有差異，且不可能所有的病害系統(tǒng)都與POD和SOD等有相同的變化關(guān)系，即使有關(guān)也可能存在程度和方法上的差異。另一方面也說明，確定某種作物抗或感某種病害除對(duì)抗性相關(guān)酶活性和個(gè)別物質(zhì)含量的變化進(jìn)行研究外，還需要對(duì)其他抗性相關(guān)系統(tǒng)作進(jìn)一步探討。

[1]Schneider S，Ullrich W.Differential induction of resistance and enhanced enzyme activities in cucumber and tobacco caused by treatment with various abiotic and biotic inducers[J].Physiol Mol Plant Pathol，1994，45：291-304.

[2]Ahl-Goy P，F(xiàn)elix G，Metraux J P，et al.Resistance to disease in the hybrid Nicotiana glutinosa x Nicotiana debneyi is associated with high constitutive levels of β-1,3-glucanase,chitinase,peroxidase and polyphenoloxidase[J]. Physiol Mol Plant Pathol，1992，41：11-21.

[3]徐建華，利容千，王建波．黃瓜不同抗病品種感染鐮刀菌枯萎病菌后幾種酶活性的變化[J]．植物病理學(xué)報(bào)，1995，25（3）：239-242.

[4]吳岳軒，曾富華，王榮臣．雜交稻對(duì)白葉枯病的誘導(dǎo)抗性與細(xì)胞內(nèi)防御酶系統(tǒng)關(guān)系的初步研究[J]．植物病理學(xué)報(bào)，1996，26（2）：127-131.

[5]王雅平，吳兆蘇，劉伊強(qiáng)．小麥抗赤霉病的生化研究及其機(jī)制的探討[J]．作物學(xué)報(bào)，1994，20（3）：327-333.

[6]李榮花，陳捷，高增貴．玉米紋枯病抗性與防御酶關(guān)系的研究[J]．天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，25（4）：32-36.

[7]徐強(qiáng)，曹碚生，江解增，等．不同抗性茭白感染紋枯病菌后4種酶活性的變化[J]．揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2005，26（1）：81-84.

[8]陳志誼，許志剛，陸凡，等．拮抗細(xì)菌B-916對(duì)水稻植株的抗性誘導(dǎo)作用[J]．西南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，14（2）：44-48．

[9]李靖，利容千，袁文靜.黃瓜感染霜霉病菌葉片中一些酶活性的變化[J].植物病理學(xué)報(bào)，1991，21(4):277-282.

[10]趙世杰，許長(zhǎng)成，鄒琦，等．植物組織中丙二醛測(cè)定方法的改進(jìn)[J]．植物生理學(xué)通訊，1994，30（3）：207-210．

[11]馬海賓，鄭服叢，康麗華.辣椒感染疫病后生化指標(biāo)的響應(yīng)研究[J].生物技術(shù)，2006，16（3）：35-38.

[12]張國(guó)良，戴其根，張洪程．施硅增強(qiáng)水稻對(duì)紋枯病的抗性[J]．植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2006，32（5）：600-606．

[13]吳岳軒，曾富華，王榮臣．雜交稻對(duì)白葉枯病的誘導(dǎo)抗性與細(xì)胞內(nèi)防御酶系統(tǒng)關(guān)系的初步研究[J]．植物病理學(xué)報(bào)，1996，26（2）：127-131.

[14]曾富華，吳岳軒，羅澤民，等．稻白葉枯病不同毒力株細(xì)菌的誘導(dǎo)抗病性與活性氧代謝的關(guān)系[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，2（6）：450-455.

[15]廖朝暉，朱必鳳，劉安玲．水稻對(duì)白葉枯病菌抗性與活性氧關(guān)系的研究[J]．中山大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，41（4）：78-81.

[16]肖用森，王正直，郭紹川．白葉枯病菌對(duì)雜交稻幼苗葉片中活性氧清除劑的影響[J]．作物學(xué)報(bào)，1998（24）：118-122.

Effects of Phytophthora capsicion Activities of Enzymes Related to Disease-resistance in Pepper

SUN Wenxiu,ZHU Xiaohui
(College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 434025)

Two resistant cultivars,Haifeng Zt-277(high resistant to Phy to phthorablight),Tangjiao No.2(resistant to Phy to phthorablight),and a susceptible cultivar Tianjiao No.2 (susceptible to Phy to phthorablight)were used as materials for Phytophthora capsiciinoculation.The activities of enzymes related to disease-resistance including superoxide dismutase (SOD),peroxidase (POD)and the content of malondialdehyde (MDA)in pepper leaves were tested after the inoculation. The results indicated that the activities of SOD and POD in resistant pepper leaves were significantly higher than those of susceptible pepper whether or not inoculated withP.capsici.However,the MDA content in the susceptible pepper was higher than that of resistant peppers.

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.12.024

本研究受長(zhǎng)江大學(xué)博士創(chuàng)新基金（2006A00433）資助

孫文秀（1979-），女，博士，講師，主要研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)。電話：13797396503

2009-02-18

Ker words:Pepper;Disease-resistance;Superoxide dismutase;Peroxidase;Malondialdehyde