閆序東，尹睿杰，王彩云，云戰(zhàn)友，李翠枝，陳忠軍，劉麗君

（1.伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司a.技術(shù)中心；b.質(zhì)量管理部,呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010080）

牛乳中α-乳白蛋白提取工藝

閆序東1a，尹睿杰1b，王彩云1a，云戰(zhàn)友1a，李翠枝1b，陳忠軍2，劉麗君1b

（1.伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司a.技術(shù)中心；b.質(zhì)量管理部,呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010080）

研究了熱附聚法結(jié)合凝乳酶處理從鮮牛乳中提取α-乳白蛋白的工藝，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得到富含α-乳白蛋白的乳清，其中α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的濃度比達(dá)到3.03，達(dá)到了商業(yè)化產(chǎn)品的水平。

α-乳白蛋白；β-乳球蛋白；加熱處理

0 引 言

α-La含有高比例的色氨酸及半胱氨酸，色氨酸是5-羥色胺的前體，對(duì)胃口、情緒、睡眠及生物鐘等神經(jīng)性反應(yīng)的調(diào)節(jié)具有重要功能。而半胱氨酸既是谷胱甘肽的組份，也是合成?；撬岬那绑w[1-3]。因此，對(duì)牛奶中α-La的研究和對(duì)富含α-La的乳清和乳清粉的制備工藝的探索近年來(lái)成為熱點(diǎn)。

乳清蛋白受熱易變性，許多文獻(xiàn)研究了乳清蛋白變性的動(dòng)力學(xué)規(guī)律并指出[4-6]，β-乳球蛋白（β-Lg）與α-La在特定條件下的變性速率存在差異，β-Lg與酪蛋白的附聚速率和附聚程度均高于α-La，因此，采取分離手段將β-Lg/酪蛋白附聚物與未附聚的α-La分離即可以達(dá)到富集α-La的目的，本研究即運(yùn)用該原理來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)α-La的提取分離。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與設(shè)備

鮮牛乳，皺胃酶，α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，尿素，1，3-雙（三（羥甲基）甲基）丙烷，羥丙基甲基纖維素，檸檬酸，檸檬酸三鈉，β-巰基乙醇，鹽酸，氫氧化鈉。

貝克曼MDQ毛細(xì)管電泳儀，配備二級(jí)管陣列檢測(cè)器，Beckman P／ACE Station工作站，未涂層熔融石英毛細(xì)管（45cm×50μm i.d.,Polymicro Technologies,Phoenix,AZ,USA），3k30超速離心機(jī)（Sigma），BP211D電子天平，DK-8D型電熱恒溫水槽，LSHZ-300冷凍水浴恒溫振蕩器，ZC-10型智能超級(jí)恒溫水槽，CH2122K型電磁爐，785DMP自動(dòng)電位滴定儀，CS101-2電熱鼓風(fēng)干燥箱，可調(diào)式移液器，Milli.Elix-Q超純水儀，KQ-700VDV醫(yī)用超聲波清洗器，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)玻璃儀器。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

熱處理：將脫脂乳分裝于試管中，在水浴鍋中進(jìn)行加熱處理，熱處理后迅速置于冰水中冷卻至室溫。

酶凝：在熱處理的脫脂乳中添加活力為20 000 U/g的凝乳酶0.01%及0.1%的氯化鈣，酶凝30 min后，紗布過(guò)濾分離乳清與凝塊。

1.2.2 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的檢測(cè)

樣品預(yù)處理：待測(cè)乳樣，經(jīng)60 000 g，10℃，40 min離心處理以沉降變性聚集的乳清蛋白/酪蛋白復(fù)合物，取清液并以1︰4的比例與pH值7.50尿素緩沖液混合，加入體積分?jǐn)?shù)為5‰的巰基乙醇后待測(cè)。

檢測(cè)條件：超純水清洗毛細(xì)管柱：壓力為1.38×105Pa，時(shí)間為3.0 min；運(yùn)行緩沖液清洗毛細(xì)管柱壓力為1.38×105Pa，時(shí)間為3.0 min；壓力進(jìn)樣為3.44×103Pa，時(shí)間為10 s；分離電壓為28 kV；柱溫為25℃；二極管陣列檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；運(yùn)行緩沖液為pH值為3.00的檸檬酸緩沖液。

1.2.3 提取工藝的優(yōu)化

pH值：將鮮脫脂乳調(diào)節(jié)至6.00，5.80，5.60，5.40，5.20，5.00，4.80，4.60；在80℃下保溫20 min；之后測(cè)定α-乳白蛋白及β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度。

熱處理溫度：將鮮脫脂乳調(diào)節(jié)至一定的pH值，在70，75，80，85，90℃保溫5 min， 之后測(cè)定α-乳白蛋白及β-乳球蛋白質(zhì)量濃度。

熱處理時(shí)間：將鮮脫脂乳調(diào)節(jié)至一定pH值，在一定的溫度下保溫5，10，15，20，25，30 min，之后測(cè)定α-乳白蛋白及β-乳球蛋白質(zhì)量濃度。

正交試驗(yàn)：選取單因素實(shí)驗(yàn)的pH值、熱處理溫度、時(shí)間的較優(yōu)水平，開展三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值

加熱處理中乳清蛋白會(huì)變性并與酪蛋白形成復(fù)合物。當(dāng)pH值大于6.9時(shí)，加熱處理的過(guò)程中β-乳球蛋白會(huì)與κ-酪蛋白復(fù)合并從酪蛋白膠束上解離[7]；pH值為6.83時(shí)，約有20%的κ-酪蛋白從酪蛋白膠束上解離，不利于β-乳球蛋白與酪蛋白的結(jié)合；pH值在6.5～6.7范圍內(nèi)時(shí)，β-乳球蛋白與κ-酪蛋白復(fù)合并能夠穩(wěn)定酪蛋白的膠束結(jié)構(gòu)[8]。針對(duì)降低pH值是否可以顯著改變?nèi)榍宓鞍着c酪蛋白的復(fù)合程度[9]進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

以α-乳白蛋白與β-乳球蛋白質(zhì)量濃度之比間接代表α-乳白蛋白的純度。由圖1可以看出，脫脂乳的pH值為5.0時(shí)，α-乳白蛋白與β-乳球蛋白質(zhì)量濃度之比最高，即α-乳白蛋白的純度最高，而α-乳白蛋白的質(zhì)量濃度隨pH值的下降而緩慢降低，綜合考慮質(zhì)量濃度與純度，選擇脫脂乳的最優(yōu)pH值為5.0。

2.2 熱處理溫度的確定

將pH值為5.0的脫脂乳，分別加熱至70，75，80，85，90℃，保溫5 min，超速離心后取上清液，用毛細(xì)管電泳法測(cè)定其中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，隨著加熱溫度的升高，α-乳白蛋白的質(zhì)量濃度逐漸減少；溫度為80℃時(shí)，α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度比最大，對(duì)應(yīng)的值為1.55，因此，80℃是最優(yōu)的處理溫度。

加熱過(guò)程中，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的變性速率和程度不斷升高，β-乳球蛋白與酪蛋白膠束復(fù)合的速率及程度高于α-乳白蛋白，所以α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的濃度之比逐漸升高，之后，隨著α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的變性和復(fù)合速率差異的縮小，α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度比又逐漸下降。

2.3 熱處理時(shí)間的確定

將pH值為5.0的脫脂乳，加熱至80℃，分別保溫5，10，15，20 min、25 min、30 min后， 超速離心取上清液，用毛細(xì)管電泳法測(cè)定其中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，α-乳白蛋白的質(zhì)量濃度逐漸減少，而α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的濃度比則呈上升趨勢(shì)。保溫時(shí)間為20 min時(shí)，α-乳白蛋白的純度基本趨于穩(wěn)定，而它的質(zhì)量濃度還將繼續(xù)下降，因此選擇20 min為最優(yōu)熱處理時(shí)間。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇主要影響因素：脫脂乳pH值、加熱溫度和保溫時(shí)間，進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 L9（33）加熱處理正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2.4.1 考慮α-乳白蛋白的純度

經(jīng)過(guò)不同加熱條件處理后，脫脂乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白直接或間接地與酪蛋白發(fā)生不同程度的復(fù)合，加熱的溫度越高，復(fù)合物形成的速度越快，保溫時(shí)間越長(zhǎng)，反應(yīng)的程度越高[10]。

經(jīng)過(guò)加熱處理的脫脂乳，通過(guò)超速離心得到上清液，用毛細(xì)管電泳法測(cè)定其中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的濃度。

α-乳白蛋白的純度越高，說(shuō)明與酪蛋白復(fù)合的β-乳球蛋白越多，而與酪蛋白復(fù)合的α-乳白蛋白則較少。在此，把α-乳白蛋白的純度作為衡量熱處理作用的指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2和圖4所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，最優(yōu)的處理組合為A2B3C2，即8號(hào)實(shí)驗(yàn)組。其α-乳白蛋白與β-乳球蛋白質(zhì)量濃度之比的值為4.02。比較本研究中A，B，C三因素R值的大小，可以看出：最重要的影響因素為B因素（溫度）；其次為A因素（pH值）；最后為C因素（保溫時(shí)間）。

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)中的3個(gè)因素，即pH值、溫度和保溫時(shí)間，進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 方差分析結(jié)果

由表3可以看出，pH值、溫度和保溫時(shí)間3個(gè)因素的F值均不顯著，但從方差分析的結(jié)果中可以看出各因素的相對(duì)重要性，即：B因素為重要因素，A因素次之，C因素再次。方差分析結(jié)果同直觀分析一致。

2.4.2 考慮α-乳白蛋白的質(zhì)量濃度

α-乳白蛋白的質(zhì)量濃度在一定程度上反映α-乳白蛋白與其他蛋白質(zhì)的復(fù)合程度，是除α-乳白蛋白的純度之外另一個(gè)衡量熱處理作用的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和圖5所示；分析結(jié)果如表4所示。

結(jié)果表明：最優(yōu)的處理組合為A1B1C1。比較本試驗(yàn)中A，B，C三因素R值的大小，可以看出：最重要因素為C因素，即保溫時(shí)間；其次為B因素，即溫度；最后為A因素，即pH值。

表4 方差分析結(jié)果

由表4可以看出，實(shí)驗(yàn)總體在0.05水平下顯著，其中C因素極顯著，B因素極顯著，A因素顯著，同直觀分析的結(jié)果一致。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)所得的最佳熱處理?xiàng)l件重復(fù)試驗(yàn)。對(duì)A2B3C2和A1B1C1組合分別進(jìn)行了5次平行試驗(yàn)，A2B3C2組合所得樣品中α-乳白蛋白的純度均大于4.02，組合A1B1C1所得樣品中α-乳白蛋白的質(zhì)量濃度均大于0.99g/L。故有這樣的結(jié)論：從α-乳白蛋白的濃度方面講A1B1C1組合是最優(yōu)的，從α-乳白蛋白的純度方面講A2B3C2組合是最優(yōu)的。

由表2可以看出，質(zhì)量濃度大于0.60 g/L并且α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的比值大于2的試驗(yàn)組有4號(hào)和7號(hào)，7號(hào)的α-乳白蛋白的純度明顯高于4號(hào)，α-乳白蛋白的濃度相接近，故7號(hào)試驗(yàn)組為最佳組合，即A1B3C1，對(duì)應(yīng)的α-乳白蛋白的質(zhì)量濃度為0.68 g/L，α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的比值為3.03。

3 結(jié) 論

脫脂乳熱處理的最佳條件為：pH值5.0，溫度80℃，保溫時(shí)間15 min。從α-乳白蛋白的純度方面考慮，3個(gè)因素的主次順序?yàn)椋簻囟龋緋H值＞保溫時(shí)間；從α-乳白蛋白的濃度方面考慮，3個(gè)因素的主次順序?yàn)椋罕貢r(shí)間＞溫度＞pH值。

[1]OROSCO M,ROUCHA C.Alpha-Lactalbumin-Enriched Diets Enhance Serotonin Release and Induce Anxiolytic and Rewarding Effects in the Rat[J].Behavioural Brain Research,2004,148：1–10.

[2]EUGENE A P,LAWRENCE J B.α-Lactalbumin：Structure and Function[J].FEBS Letters,2000,473：269-274.

[3]JOLINE W J,BEULENS.Alpha-Lactalbumin Combined with a Regular Diet Increases Lasma Trp–LNAA Ratio[J].Physiology&Behavior 2004,81：585–593.

[4]HAE D J,HAROLD E,SWAlSGOOD.Disulfide Bond Formation Between Thermally Denatured β-Lactoglobulin and κ-Casein in Casein Micelles[J].Journal of Dairy Science,1990,73（4）：900-904.

[5]KIESNER K.Manufacturing of α-Lactalbumin-Enriched Whey Systems by Selective Thermal Treatment in Combination with Membrane Processes[J].Lait，2000,80：99-111.

[6]DAVID J,OLDFIELD.Kinetics of Denaturation and Aggregation of Whey Proteins in Skim Milk Heated in an Ultra-high Temperature（UHT）Pilot Plant[J].Dairy Journal,1998,8：311-318.

[7]HOFFMANN M A M,VANMIL P J J M.Heat-Induced Aggregation of β-Lactoglobulin：Role of the Free Thiol Group and Disulphide Bonds[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry,1997,45：2942-2945.

[8]CORREDIG M,DALGLEISH D G.Effect of Temperature and pH on the Interactions of Whey Proteins with Casein Micelles in Skim Milk[J].Food Research International,1996,29：49-50.

[9]RHAM O,CHANTON S.Role of Ionic Environment in Insolubilization of Whey Protein during Heat Treatment of Whey Products[J].Journal of Dairy Science,1984,67：939-947.

[10]OLDFIELD D J,SINGH H,TAYLOR M W,et al.Kinetics of Denaturation and Aggregation of Whey Proteins in Skim Milk Heated in an Ultra-High Temperature（UHT）Plant[J].International Dairy Journal,1998,8：311-317.

Process for producing α-lactalbumin-enriched whey

YAN Xu-dong1a,YIN Rui-jie1b,WANG Cai-yun1a,YUN Zhan-you1a,LI Cui-zhi1b,CHEN Zhong-jun2,LIU Li-jun1b
（1.Inner Mongolia Yili Industrial Group Co.Ltd，a.Technology Center；b.Department of Quality Management,,Huhhot 010080,China；2.College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China）

A process for producing an α-lactalbumin-enriched fraction from milk was investigated.The ratio of the concentration of α-lactalbumin to β-lactoglobulin is 3.03,which is high enough to meet the level of comerical products.

α-lactalbumin;β-lactoglobulin;heat-treatment

Q935

A

1001-2230（2010）11-0007-04

2010-07-02

國(guó)家十一五科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目（2006BAD04A06）。

閆序東（1983-），男，碩士，研究方向?yàn)槿槠芳庸すに嚒?/p>

云戰(zhàn)友