王曉輝 徐國(guó)興 潘永明

ICAM-1在大鼠STZ糖尿病性白內(nèi)障中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

王曉輝1徐國(guó)興1潘永明2

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科 2.河南省洛陽(yáng)醫(yī)院眼科

目的：觀察糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1（TGF-β1）、細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）和Ⅰ-膠原 （COL-Ⅰ）的表達(dá)，用以研究ICAM-1在糖性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制中的作用。方法：120只SD大鼠隨機(jī)分為兩組，在糖尿病組中，一次性腹腔注射STZ建立糖尿病模型；用免疫組化SP法分別于2、4、8周末觀察糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中ICAM-1、TGF-β1和COL-Ⅰ表達(dá)變化及其相關(guān)性。結(jié)果：在糖性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞中ICAM-1、 TGF-β1和COL-Ⅰ的表達(dá)明顯增高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且TGF-β1與ICAM-1和 COL-Ⅰ之間的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論：在糖性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞中ICAM-1的表達(dá)明顯增高，TGF-β1可以促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞ICAM-1和COL-Ⅰ的表達(dá)，ICAM-1通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附，促進(jìn)HLEC的粘附、增生和移行，從而在糖性白內(nèi)障中發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞間粘附分子-1 糖尿病性白內(nèi)障 晶狀體上皮細(xì)胞 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1 Ⅰ-膠原

糖尿病性白內(nèi)障常見的病理變化是在晶狀體前囊膜下和后囊膜下發(fā)生混濁[1]。當(dāng)晶狀體發(fā)生前、后囊膜下型白內(nèi)障時(shí)，晶狀體上皮細(xì)胞形成斑片樣多層生長(zhǎng)并出現(xiàn)類似梭狀的形態(tài)特點(diǎn)，甚至呈成纖維細(xì)胞樣改變，同時(shí)在前囊膜下型白內(nèi)障的混濁斑塊中存在Ⅰ型膠原和粘蛋白的表達(dá)[2]。以往研究表明，TGF-β1也能引起晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生斑片樣多層生長(zhǎng)并出現(xiàn)類似梭狀的形態(tài)特點(diǎn)[3],但其作用機(jī)制尚不明確。粘附分子是一類介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間粘附作用的膜表面糖蛋白，Nishi等[4]發(fā)現(xiàn)術(shù)后即取的和培養(yǎng)的晶體上皮細(xì)胞都表達(dá)ICAM-1。因此我們推測(cè)，在糖性白內(nèi)障的發(fā)生過(guò)程中，TGF-β1在誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原的同時(shí)，也誘導(dǎo)ICAM-1的表達(dá)增強(qiáng)，通過(guò)ICAM-1介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的粘附，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生斑片樣多層生長(zhǎng)，導(dǎo)致白內(nèi)障的形成。我們通過(guò)建立鏈脲佐菌素大鼠糖尿病性白內(nèi)障模型，檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞（LECs）中ICAM-1、TGF-β1及COL-I的表達(dá)的變化規(guī)律，研究ICAM-1在糖尿病性白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。SD大鼠（福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：2002-0006）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

鏈脲佐菌素（Sigma 公司），小鼠抗大鼠ICAM-1抗體、兔抗大鼠TGF-β1抗體、兔抗大鼠COL-Ⅰ抗體（武漢博士德公司），SP免疫組化超敏試劑盒（福州邁新生物公司）。

1.3 主要儀器

OLMPUS 數(shù)碼相機(jī)（C3040-ABU）、OLMPUS 光學(xué)顯微鏡（BH-2）、one touchⅡ血糖測(cè)定儀、電子分析天平（FA1104）、石蠟切片機(jī)(LKB-Nova 5型) 。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 建立糖尿病動(dòng)物模型。大鼠禁食12h后，一次性腹腔注射劑量為70mg/kg的2%STZ溶液（用pH4.5，0.1mol/L的檸檬酸緩沖液臨時(shí)配置），三天后采大鼠尾靜脈血測(cè)血糖濃度，血糖濃度在16.7mmol/L以下的則不能視為糖尿病的大鼠。正常組僅給予腹腔注射pH4.5，0.1mol/L的檸檬酸緩沖液。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)和方法。從腹腔注射STZ開始，用裂隙燈檢察晶狀體變化（每周1次）并監(jiān)測(cè)血糖（每?jī)芍芤淮危７謩e于實(shí)驗(yàn)開始后2周末、4周末及8周末，白內(nèi)障組和正常組大鼠各取20只（40只眼），測(cè)血糖，稱重，取眼球。取出的眼球立即用10%中性福爾馬林液固定，制成0.4μm厚的石蠟切片。

2.3 免疫組織化學(xué)染色SP法檢測(cè)ICAM-1、TGF-β1和COL-Ⅰ表達(dá),免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟按Ultra Sensitive SP超敏試劑盒免疫組化染色步驟進(jìn)行。

2.4 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

ICAM-1主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，陽(yáng)性反應(yīng)為棕黃色顆粒。TGF-β1和COL-Ⅰ主要表達(dá)于細(xì)胞漿，陽(yáng)性反應(yīng)為棕黃色顆粒。在光鏡下隨機(jī)選擇觀察50個(gè)晶狀體上皮細(xì)胞，用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比來(lái)表示陽(yáng)性表達(dá)率。采用兩因素的方差分析、直線相關(guān)分析，以P＜0.05作為差別有顯著意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，所有統(tǒng)計(jì)均在SPSS11.0軟件上運(yùn)行。

3 結(jié)果

3.1 血糖測(cè)定結(jié)果。白內(nèi)障組大鼠血糖在STZ注射后第3天起至第8周末均保持較高的水平；而正常組大鼠的血糖值一直保持在正常值范圍（詳見表1）：

表1 血糖測(cè)定結(jié)果（mmol/L,）

3.2 裂隙燈下大鼠晶狀體變化情況。正常組大鼠晶狀體始終保持透明；而白內(nèi)障組大鼠在第2周末在晶狀體可見空泡出現(xiàn)，第4周末可見晶狀體周邊部出現(xiàn)白色絮狀混濁，到第8周末混濁程度增加，混濁范圍擴(kuò)大。

3.3 TGF-β1的表達(dá)。正常組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中可見到少數(shù)TGF-β1蛋白表達(dá)；白內(nèi)障組的晶狀體上皮細(xì)胞中可見TGF-β1明顯表達(dá)。兩組間的差異有顯著性（t2周末=13.826，t4周末=35.012，t8周末=48.523，各組間均P<0.05）；在三個(gè)時(shí)間組中，白內(nèi)障組的TGF-β1表達(dá)逐漸增多（F=503.25,P<0.05；SNK法兩兩比較各組間均P<0.05）；而正常組的TGF-β1表達(dá)無(wú)明顯變化（F=0.266,P=0.650）(圖1)。

圖1 TGF-β1在STZ-糖尿病大鼠LECs中的表達(dá)

3.4 ICAM-1蛋白的表達(dá)。正常組晶狀體上皮細(xì)胞中未見到ICAM-1表達(dá)；白內(nèi)障組中晶狀體上皮細(xì)胞膜可見棕黃色顆粒，表明ICAM-1表達(dá)明顯。兩組間的差異均有顯著性（t2周末=27.214，t4周末=60.542，t8周末=70.259，各組間P<0.01）；在三個(gè)時(shí)間組中，白內(nèi)障組的ICAM-1表達(dá)逐漸增多（F=98.235, P<0.01；SNK法兩兩比較各組間P<0.05）；而正常組的無(wú)明顯變化（F=0.254,P>0.05）(圖2)。

圖2 ICAM-1在STZ-糖尿病大鼠LECs中的表達(dá)

3.5 COL-Ⅰ的表達(dá)。正常組晶狀體上皮中未見到COL-Ⅰ的表達(dá)；白內(nèi)障組的晶狀體上皮細(xì)胞漿內(nèi)可見多數(shù)COL-Ⅰ棕黃色顆粒。兩組間的差異有顯著性（t2周末=48.56，t4周末=40.84，t8周末=30.54，各組間均P<0.05）；在三個(gè)時(shí)間組中，白內(nèi)障組的細(xì)胞陽(yáng)性率逐漸增高（F=385.234,P<0.05；SNK法兩兩比較各組間均P<0.05）；而正常組的細(xì)胞COL-Ⅰ陽(yáng)性率率無(wú)明顯變化（F=1.235,P=0.401）(圖3)。

圖3 COL-Ⅰ在STZ-糖尿病大鼠LECs中的表達(dá)

3.6 兩組LECs中TGF-β1、ICAM-1和COL-Ⅰ的表達(dá)情況比較（表2）及相關(guān)分析。經(jīng)直線相關(guān)分析，在白內(nèi)障發(fā)展過(guò)程中，TGF-β1與ICAM-1和COL-Ⅰ的表達(dá)變化呈正相關(guān)(r=0.623，P<0.05/(r=0.663，P<0.05) (圖4，圖5)。

表2 正常組與白內(nèi)障組的LECs中TGF-β1、ICAM-1和COL-Ⅰ的表達(dá)情況（%,x±s ）

圖4 TGF-β1與ICAM-1的表達(dá)關(guān)系散點(diǎn)圖

圖5 TGF-β1與COL-Ⅰ的表達(dá)關(guān)系散點(diǎn)

4 討論

在正常情況下，晶狀體上皮細(xì)胞為單層細(xì)胞，排列極為規(guī)則[1]。當(dāng)晶狀體上皮細(xì)胞的這種正常的結(jié)構(gòu)和排列發(fā)生改變時(shí)，晶狀體就可能發(fā)生混濁而導(dǎo)致白內(nèi)障的形成。研究表明，晶狀體上皮細(xì)胞可緩慢增殖、移行，并在一定條件下轉(zhuǎn)化為纖維細(xì)胞從而促進(jìn)纖維化的形成。糖尿病性白內(nèi)障最常見的病理改變?yōu)榫铙w前、后囊膜下混濁[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)晶狀體發(fā)生前、后囊膜下型白內(nèi)障時(shí)，晶狀體上皮細(xì)胞形成斑片樣多層生長(zhǎng)并出現(xiàn)類似梭狀的形態(tài)特點(diǎn)，甚至呈成纖維細(xì)胞樣改變，同時(shí)在前囊膜下型白內(nèi)障的混濁斑塊中存在Ⅰ型膠原和粘蛋白的表達(dá)[2]。本實(shí)驗(yàn)表明，STZ造成Ⅰ型糖尿病的高血糖狀態(tài)并最終引起晶體混濁而形成白內(nèi)障。在光鏡下，正常對(duì)照組晶狀體上皮細(xì)胞呈單層排列，較為規(guī)律。而在糖性白內(nèi)障組中，晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生了斑片樣聚集生長(zhǎng)、形成復(fù)層結(jié)構(gòu)的病理特征，并似梭形細(xì)胞至成纖維細(xì)胞樣，與前囊膜下白內(nèi)障和后囊膜混濁的病理特征相似。

近年來(lái)研究表明，TGF-β也可誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞產(chǎn)生斑片樣多層生長(zhǎng)并出現(xiàn)類似梭狀的形態(tài)特點(diǎn)，甚至呈成纖維細(xì)胞樣改變的病理變化，并在白內(nèi)障發(fā)生過(guò)程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可引起大鼠晶體上皮細(xì)胞伸長(zhǎng)、異常排列和增殖、胞外基質(zhì)堆積增厚，囊膜皺縮[3]。而在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)正常大鼠的晶狀體存在TGF-β1低水平的表達(dá)，而糖性白內(nèi)障組中存在明顯的表達(dá)，證實(shí)了TGF-β1在糖性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制中的重要作用；TGF-β1隨著病程的發(fā)展進(jìn)行性表達(dá)增強(qiáng)，反應(yīng)TGF-β1對(duì)于晶狀體上皮發(fā)生斑片樣狀增生和梭形變化起著重要作用，符合糖性白內(nèi)障發(fā)展的病理生理過(guò)程。

細(xì)胞外基質(zhì)( extra cellular matrix,ECM)是機(jī)體內(nèi)多種器官組織生存的細(xì)胞外骨架。細(xì)胞外基質(zhì)由細(xì)胞合成分泌而來(lái)，它們對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等具有趨化作用，促進(jìn)細(xì)胞在基質(zhì)上的粘附，進(jìn)而使細(xì)胞快速增殖。Nishi等有報(bào)道[4]，體外培養(yǎng)的白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞可以合成分泌Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ各型膠原。國(guó)內(nèi)張曉紅等[5]的結(jié)果表明，部分白內(nèi)障患者晶狀體囊中有Ⅰ型膠原的存在，可能來(lái)自其下面的晶狀體上皮細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在正常晶狀體上皮中不表達(dá)Ⅰ型膠原，而在糖性白內(nèi)障組中出現(xiàn)Ⅰ型膠原的明顯表達(dá)，且隨著病程的發(fā)展進(jìn)行性表達(dá)增強(qiáng)，表明Ⅰ型膠原在糖性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制中的重要作用，Ⅰ型膠原是一種纖維性膠原，作為晶狀體上皮細(xì)胞的細(xì)胞外骨架，它在細(xì)胞的移行、增殖、化生以及組織的疤痕化中起重要作用，因而可導(dǎo)致晶狀體上皮發(fā)生斑片狀多層聚集和梭形變化，白內(nèi)障形成。

粘附分子是一類介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間粘附作用的膜表面糖蛋白，它們?cè)谂咛サ陌l(fā)育分化、正常組織結(jié)構(gòu)的維持、炎癥與免疫應(yīng)答、刨傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理病理過(guò)程中具有重要作用。晶狀體上皮細(xì)胞能表達(dá)多種細(xì)胞粘附分子，如整聯(lián)蛋白( integrin)、ICAM- 1、CD44等.通過(guò)這些細(xì)胞粘附分子，晶狀體上皮細(xì)胞得以粘附在其下方的囊膜上，細(xì)胞粘附分子可能參與白內(nèi)障術(shù)后晶狀體上皮細(xì)胞移行至后囊膜過(guò)程中的細(xì)胞脫落與粘附[6]。ICAM-1是Rothlein等于1986年研究淋巴細(xì)胞黏附時(shí)發(fā)現(xiàn)的[7]，克隆號(hào)CD54，屬免疫球蛋白超家族成員，是分子量為80～110KD的單鏈糖蛋白[8,9]，具有5個(gè)細(xì)胞外串聯(lián)的單鏈免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和1個(gè)胞質(zhì)尾樣結(jié)構(gòu)域。在體內(nèi)ICAM-1有二種存在形式，一種為膜型，是一種細(xì)胞表面跨膜蛋白抗原。另一種是可溶型(sICAM-1)，它被認(rèn)為是在一些因素作用下，由膜型ICAM-1從細(xì)胞表面脫落而形成，包括有膜型ICAM-1胞外區(qū)的D1D2D4D5的全部或大部分片段，存在于血循環(huán)中。Nishi等[6]用免疫組化染色測(cè)定人晶體上皮細(xì)胞的粘附分子的表達(dá)，白內(nèi)障摘除術(shù)中做環(huán)形前囊膜切除后，將獲取的前囊晶體上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)2周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后即取的和培養(yǎng)的晶體上皮細(xì)胞都表達(dá)ICAM-1、β1-整合素、CD44。當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入ICAM-1、β1-整合素、CD44的單克隆抗體（10mg/mL）后，晶體上皮細(xì)胞在前囊膜的膠原和層粘連蛋白基質(zhì)上的增殖和移位受到明顯的抑制。從該研究可以看出發(fā)生白內(nèi)障的人晶體上皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)增加。近年有研究表明，晶體上皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用的改變和異常可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)異常，從而導(dǎo)致晶狀體前、后囊膜下纖維化[10]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在正常組晶狀體上皮細(xì)胞中不表達(dá)，而糖性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞中ICAM-1存在明顯的表達(dá)，且隨著白內(nèi)障病程的發(fā)展，ICAM-1的表達(dá)呈進(jìn)行性增加。結(jié)合Nishi等的研究，我們可以推測(cè)ICAM-1不僅可以促進(jìn)晶體上皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上生長(zhǎng)和移行，而且促進(jìn)了晶體上皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附作用。因此推測(cè)ICAM-1是通過(guò)促進(jìn)晶體上皮細(xì)胞的增殖、移行及改變晶體上皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附狀態(tài)的機(jī)制在白內(nèi)障發(fā)生中發(fā)揮重要的作用。

在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)隨著白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的推移，晶狀體混濁程度不斷加深，晶體上皮細(xì)胞中TGF-β1、ICAM-1和COL-Ⅰ表達(dá)明顯增加，各時(shí)間段間的差異有顯著性；而且TGF-β1、ICAM-1和COL-Ⅰ的表達(dá)變化具有高度正相關(guān)。由此表明TGF-β1在糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生過(guò)程中有一定調(diào)節(jié)作用，并且可以增加晶狀體上皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)成分COL-Ⅰ和ICAM-1，推測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞與ECM之間的相互作用是通過(guò)調(diào)節(jié)晶體上皮細(xì)胞中ICAM-1的轉(zhuǎn)錄活性而發(fā)揮作用的。ICAM-1的過(guò)量表達(dá)可由TGF-β1所誘導(dǎo)，并通過(guò)促進(jìn)晶體上皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分的粘附，改變晶體上皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附狀態(tài)，從而在晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生移行、轉(zhuǎn)分化和增殖中發(fā)揮起始作用，促進(jìn)糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。

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福建省衛(wèi)生廳青年科研基金資助項(xiàng)目（課題編號(hào)：2005-2-37）。