趙胤澤 汪琳 柏亞鐸 邢佑尚

(1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026;2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué))

1 前言

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)是人類(lèi)按照自己的意愿有目的、有計(jì)劃、有根據(jù)、有預(yù)見(jiàn)地改變動(dòng)物的遺傳組成,是基于現(xiàn)代分子生物學(xué)、動(dòng)物胚胎學(xué)和配子生物工程技術(shù)的一項(xiàng)綜合技術(shù)。盡管對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)際應(yīng)用還有許多關(guān)鍵性的技術(shù)問(wèn)題需要解決,但轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生物基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域已顯示了廣闊的應(yīng)用前景。隨著基因工程的不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)將不斷得到完善,可以廣泛運(yùn)用到未來(lái)的生產(chǎn)和生活中。

2 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物建立人類(lèi)疾病和藥物篩選模型

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為疾病模型可以替代傳統(tǒng)的動(dòng)物模型進(jìn)行病理治療研究和新藥篩選。一般認(rèn)為,除外傷外,幾乎所有疾病都有一定程度的遺傳因素參與,研究遺傳與疾病的關(guān)系有非常重要的意義。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)可以建立敏感動(dòng)物品系及產(chǎn)生與人類(lèi)疾病相同的疾病動(dòng)物模型,可以闡明遺傳改變所產(chǎn)生的效應(yīng),確定致病基因的功能和致病機(jī)理,以便進(jìn)行科學(xué)的診治。這種動(dòng)物模型用于新藥篩選準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、試驗(yàn)次數(shù)少,現(xiàn)已成為人們進(jìn)行“快速篩選”的一種手段,目前已有不少成功的例子。如將功能缺陷的基因?qū)胄∈笊臣?xì)胞中,制備得到遺傳性疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型;將βs-珠蛋白基因和人α-珠蛋白基因在 LCR控制下轉(zhuǎn)入小鼠制得了鐮刀狀細(xì)胞貧血小鼠模型,豐富了對(duì)人鐮刀狀細(xì)胞貧血的認(rèn)識(shí)和病程的了解,并且可以用于研究藥物作用及作用的部位,也可用于基因治療的研究。

在糖尿病的治療研究中,人們發(fā)現(xiàn)功能性胰島β細(xì)胞的數(shù)量決定了糖尿病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后[1～2]。斑馬魚(yú)具有體外受精、胚胎期透明、高產(chǎn)和體積小等諸多生物學(xué)研究的優(yōu)勢(shì),夏銘等[3]運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù),將胰島斑馬魚(yú)基因組,以可視化的熒光蛋白素基因特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光蛋白的表達(dá)構(gòu)件導(dǎo)入來(lái)示蹤胰島β細(xì)胞發(fā)育的情況,以研究胰島β細(xì)胞發(fā)育、分化等相關(guān)作用。由于胰島β細(xì)胞是體內(nèi)唯一表達(dá)胰島素的器官,所以當(dāng)胰島素開(kāi)始表達(dá)時(shí),熒光蛋白共表達(dá)于胰島β細(xì)胞,通過(guò)先進(jìn)的體內(nèi)攝像系統(tǒng),跟蹤它們的起源、發(fā)育和分化等相關(guān)作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的標(biāo)記[4];同時(shí)今后可以利用這些細(xì)胞的分子標(biāo)記分離這群細(xì)胞,成為分析基因表達(dá)和基因功能的重要工具[5],運(yùn)用原位雜交技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源性胰島素基因的探測(cè)。目前斑馬魚(yú)已經(jīng)成為最先進(jìn)的脊椎動(dòng)物模型,其胚胎期透明的優(yōu)勢(shì)與熒光素報(bào)告基因結(jié)合的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的建立,可以在活體通過(guò)示蹤熒光蛋白標(biāo)記的胰島β細(xì)胞,研究胰島β細(xì)胞發(fā)育,并提供了一個(gè)進(jìn)行胰島β細(xì)胞損傷和再生研究的新型遺傳學(xué)動(dòng)物模型。

3 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究基因的功能和作用

在研究基因功能方面,人們大量使用了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)。在此僅敘述幾例。

(1)Dkks基因是近幾年發(fā)現(xiàn)的編碼分泌性Wnt拮抗劑的一個(gè)小家族,家族成員 Dkk3與同族其它成員性質(zhì)差別較大。所有的 Dkks于調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的組織中有明顯的表達(dá)增加[6],其可能于間質(zhì)和上皮細(xì)胞中發(fā)揮誘導(dǎo)性相互作用,表明它們可能參與心臟、牙齒、頭發(fā)和胡須囊泡以及肢體和骨的誘導(dǎo)作用。盡管有關(guān) Dkk家族的研究報(bào)道較多,但對(duì)Dkk3的研究較少,其生物學(xué)作用仍有大量未知數(shù)[7]。利用生物信息學(xué)分析軟骨內(nèi)骨的形成模型時(shí),發(fā)現(xiàn)Dkk3是眾多表達(dá)上調(diào)基因之一,表明Dkk3對(duì)骨形成可能具有重要的調(diào)節(jié)作用。

呂丹等[8]建立系統(tǒng)性表達(dá) Dkk3轉(zhuǎn)基因小鼠,以對(duì)其生理功能特別是對(duì)骨發(fā)育的作用進(jìn)行深入研究提供模型動(dòng)物,通過(guò) ISH來(lái)觀察 Dkk3于C57BLP6J小鼠全身組織中的表達(dá)。把 Dkk3基因插入系統(tǒng)性表達(dá) CMV啟動(dòng)子下游,構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,顯微注射法建立 C57BLP6J Dkk3轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型,RT-PCR檢測(cè)Dkk3在骨髓中的表達(dá),Western Blot檢測(cè) Dkk3在肺臟、腦及肝臟中的表達(dá),BrdU標(biāo)記染色觀察轉(zhuǎn)基因小鼠骨生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示在生理狀態(tài)下,Dkk3基因廣泛表達(dá),在骨、心臟及腦等組織高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn) Dkk3可能對(duì)成骨作用具有抑制作用,但是對(duì)軟骨形成無(wú)作用,表明 Dkk3在軟骨內(nèi)骨形成中具有重要的調(diào)節(jié)作用,此轉(zhuǎn)基因小鼠為 Dkk3對(duì)骨生長(zhǎng)發(fā)育的作用研究提供了有價(jià)值的工具動(dòng)物。

(2)WIF-1(Wnt inhibitory factor-1)是 wntPβ-catenin信號(hào)通路屬于 sFRP一類(lèi)的拮抗物之一,其作用方式是通過(guò)與Wnt蛋白直接結(jié)合阻止了Wnt與受體蛋白復(fù)合物的結(jié)合,使細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin由于磷酸化而不能積累,從而阻斷了 WntPβcatenin經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路[9]。周文君等[10]建立心臟特異表達(dá) W IF-1轉(zhuǎn)基因小鼠,研究該基因在心臟中表達(dá)對(duì)小鼠心臟發(fā)育、形態(tài)和功能維持中的作用。通過(guò) RT-PCR法克隆人W IF-1基因,把W IF-1基因插入α-MHC啟動(dòng)子下游,插入 PMD-18T載體構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,通過(guò)顯微注射法建立轉(zhuǎn) WIF-1 C57BLP6J小鼠。利用特異引物PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的基因表型,RT-PCR和Western blot檢測(cè)基因表達(dá)水平,超聲檢測(cè)不同月齡W IF-1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能變化。心臟超聲檢查證實(shí),W IF-1轉(zhuǎn)基因小鼠與對(duì)照小鼠比較,左心室重量減小,舒張期左室內(nèi)徑和容積變小,每搏輸出量和心輸出量減小,證明W IF-1基因是心臟功能的負(fù)調(diào)控因子。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)還廣泛地應(yīng)用于研究調(diào)控基因與結(jié)構(gòu)基因之間的關(guān)系、順式調(diào)控區(qū)元件對(duì)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的影響、結(jié)構(gòu)基因的組成對(duì)表達(dá)的影響和基因表達(dá)的時(shí)間空間順序等方面。人們很早就知道基因表達(dá)的時(shí)空順序是由某些激素類(lèi)信號(hào)、鄰近組織產(chǎn)生的誘導(dǎo)物等因素調(diào)節(jié),但是,只有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物出現(xiàn)之后,人們才能真正比較方便地證實(shí)高等動(dòng)物基因表達(dá)的時(shí)間空間順序的調(diào)控機(jī)制。

4 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在病毒研究方面的應(yīng)用

病毒一般均存在嗜親性,因?yàn)樵诿舾屑?xì)胞表面上有能與病毒結(jié)合的受體,這是病毒建立感染的先決條件。但許多人類(lèi)致病病毒只感染人和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物,給研究帶來(lái)很大困難。將人的病毒受體在小鼠體內(nèi)表達(dá),使只能感染人的病毒能感染小鼠,這樣就為人類(lèi)研究病毒的致病性和防治方法提供了方便有用的動(dòng)物模型。

正常情況下 EB病毒不能感染正常小鼠的淋巴細(xì)胞,Kearns等通過(guò)顯微注射法將 EB病毒的受體基因 CR2注射至受精卵中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠,在可以表達(dá) CR2基因 mRNA的鼠系中,流式細(xì)胞儀及免疫沉淀分析顯示:15%～30%的胸腺脾淋巴結(jié)細(xì)胞的表面表達(dá) CR2基因并可結(jié)合 EB病毒,不過(guò)只有1%的細(xì)胞中有病毒進(jìn)入并復(fù)制,且 EBV的感染不使這些細(xì)胞死亡,提示 CR2基因的表達(dá)并非建立感染的唯一條件。彭銀祥等[11]還指出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在研究腫瘤病毒方面也得到廣泛應(yīng)用。

人肝炎病毒不能感染非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物,要研究肝炎病毒的致病機(jī)理、藥物療效等必須使用動(dòng)物模型。自 1985年 Chisari等首先建立 HbsAg大蛋白的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠 (transgenic mice,Tg)模型以來(lái),這類(lèi)模型已成為人們研究 HBV分子生物學(xué)、免疫學(xué)及病毒性肝炎病理發(fā)生的重要?jiǎng)游锬Ｐ蚚12]。國(guó)內(nèi)學(xué)者胡衛(wèi)江等[13]構(gòu)建了含有 HBV全基因組的 ayw型和 adr亞型的 Tg鼠,為研究分布在不同地域的 HBV亞型的分子生物學(xué)特性的差異及感染后不同表現(xiàn)提供了理想的動(dòng)物模型。第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)相繼構(gòu)建了 HBV ayw亞型、adr亞型的全基因組 Tg鼠和 HBV presS/S、HBV x adr亞型的 Tg鼠[14],已建立的乙肝 Tg鼠C572TgN(HBVadr2.0)S MMU品系,經(jīng)研究具有如下特征:HBV基因在轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中整合并能穩(wěn)定遺傳;血清中存在 HBsAg和 (或)HBeAg;肝組織有 HBsAg、HBcAg、HBxAg表達(dá);血清中存在 HBV DNA;肝組織中有病毒樣顆粒。

5 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良動(dòng)物品種和生產(chǎn)性能

(1)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可用于動(dòng)物抗病育種。通過(guò)克隆特定病毒基因組中的某些編碼片段,并進(jìn)行一定程度的修飾后轉(zhuǎn)入動(dòng)物基因組中,如果轉(zhuǎn)基因在該動(dòng)物基因組中得以表達(dá),那么,該動(dòng)物對(duì)這種病毒的感染應(yīng)具有一定的抵抗能力,或者應(yīng)能減輕該種病毒侵染時(shí)給動(dòng)物機(jī)體帶來(lái)的危害。例如 Clements等將綿羊髓鞘脫落病毒的表殼蛋白基因轉(zhuǎn)入綿羊,獲得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物抗病力明顯提高。2004年,日美聯(lián)手利用基因工程手段培育出對(duì)瘋牛病 (牛海綿狀腦病,BSE)具有免疫力的牛[15],這種轉(zhuǎn)基因牛不攜帶普里昂蛋白或其他傳染性蛋白。2005年,Donovan等[16]將編碼溶葡球菌酶的基因轉(zhuǎn)入奶牛基因組中獲得轉(zhuǎn)基因牛,證明在其乳腺中表達(dá)的溶葡球菌酶可以有效預(yù)防由葡萄球菌引起的乳房炎。

(2)飽和脂肪酸攝入過(guò)多會(huì)引起高脂血癥,而不飽和脂肪酸對(duì)健康有益。2006年 4月,美國(guó)密蘇里 -哥倫比亞大學(xué)的賴(lài)良學(xué)等[17]獲得了轉(zhuǎn)線(xiàn)蟲(chóng) fat-1基因 (ω-3去飽和酶基因)的體細(xì)胞克隆豬,在其體內(nèi)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因可以將豬體內(nèi)的ω-6系飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω-3系不飽和脂肪酸,提高了ω-3系脂肪酸含量,降低了ω-6/ω-3的比例,大大提升了豬肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

6 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人用器官移植的異體供體

由于供體器官?lài)?yán)重匱乏,人們不得不重視異種移植的研究,而研究人員普遍認(rèn)為豬是人類(lèi)器官移植的最理想供體。因?yàn)樨i的器官大小及解剖生理特點(diǎn)與人類(lèi)相似,與其它動(dòng)物相比,豬的組織相容性抗原和人類(lèi)白細(xì)胞抗原具有較高的同源性,攜帶人獸共患病病原體相對(duì)較少,容易飼養(yǎng),飼料費(fèi)用低廉,且妊娠期短,產(chǎn)仔數(shù)多,不存在倫理方面的問(wèn)題。然而,超急性排斥反應(yīng) (Hyperacute rejection,HAR)卻阻礙了異種移植的臨床應(yīng)用。為解決這一問(wèn)題,研究人員將抑制排斥反應(yīng)的 DAF(Decay accelerating facter)基因,RAC(Regulators of complement activation)基因和 MCP(Membrane-cofactor protein)基因?qū)胴i基因組,試圖把表達(dá)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)基因豬的組織和器官移植到人體。2007年,Imutran公司進(jìn)行了一次轉(zhuǎn) hDNF基因豬的腎臟與心臟移植給獼猴和狒狒的實(shí)驗(yàn),觀察到 HAR的出現(xiàn)率為 6%-11%,對(duì)照組 HAR的出現(xiàn)率為 20%-57%,公司認(rèn)為使用轉(zhuǎn) HDAF基因豬的實(shí)體器官移植到靈長(zhǎng)類(lèi)能部分抑制 HAR[11]。

當(dāng)把豬的器官移植給人體以后,人體中的天然抗體將迅速結(jié)合到豬器官的血管內(nèi)壁上,從而激活補(bǔ)體系統(tǒng),使豬的器官在數(shù)分鐘內(nèi)壞死。造成這種現(xiàn)象的原因是豬細(xì)胞表面的一個(gè)通過(guò)α(1-3)連接的半乳糖表位,人體中約有 1%的免疫球蛋白認(rèn)識(shí)這個(gè)抗原表位并發(fā)生交叉反應(yīng)。因此,阻斷這種HAR的直接方法是把豬基因中的α-1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因剔除,這樣,豬細(xì)胞就不能表達(dá)這個(gè)抗原表位,最大限度地減少 HAR。如果同時(shí)表達(dá)可緩解補(bǔ)體系統(tǒng)的其他基因,豬的器官就真能成為人體器官移植代用品的來(lái)源。2002年,Lai等和 Dai等結(jié)合基因打靶和體細(xì)胞核移植技術(shù),采用敲除α-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因(GGTA1)的胎兒成纖維細(xì)胞作核供體,成功地獲得了α-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因敲除的豬。這一研究結(jié)果將為人類(lèi)利用異種器官清除一大障礙,為生產(chǎn)可供人類(lèi)移植用的異種器官開(kāi)辟一條途徑。

7 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人藥用蛋白和營(yíng)養(yǎng)保健蛋白

用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)重組蛋白 (生物反應(yīng)器)可能是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的最大應(yīng)用。目前,把轉(zhuǎn)基因動(dòng)物當(dāng)作生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)藥用蛋白已經(jīng)受到國(guó)際社會(huì)的極大關(guān)注,不僅各國(guó)政府,一些私人集團(tuán)也不惜投入大量資金加以研究和開(kāi)發(fā)。由于許多治療性蛋白產(chǎn)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜、修飾要求高,只能使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn),而用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)成本高,難以滿(mǎn)足需求,用動(dòng)物作為生物反應(yīng)器正好滿(mǎn)足了這些要求。

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器與其他表達(dá)系統(tǒng)相比有許多獨(dú)特優(yōu)勢(shì),首先,用它生產(chǎn)的外源蛋白具有體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)外源蛋白的所有特點(diǎn)。其次,乳汁的量大、價(jià)格低廉,乳腺還有良好的滲透屏障,能有效地抑制目的蛋白返回動(dòng)物血中,不影響動(dòng)物的生理活動(dòng)。乳腺生物反應(yīng)器與傳統(tǒng)的細(xì)菌和細(xì)胞發(fā)酵系統(tǒng)相比,幾乎克服了后兩者的所有缺點(diǎn)而兼具兩者的所有優(yōu)點(diǎn)。

乳腺生物反應(yīng)器作為一種全新生產(chǎn)模式,在生產(chǎn)高附加值蛋白方面展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。2004年,Reh等[18]將大鼠硬脂酰輔酶 A的基因轉(zhuǎn)入羊體內(nèi),獲得的轉(zhuǎn)基因羊乳汁中單不飽和脂肪酸和共軛亞油酸含量明顯提高,對(duì)心血管病人的健康非常有益。2006年,美國(guó)科學(xué)家Maga等[19]培育出乳汁中分泌有人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因山羊,奶樣的飼喂實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)基因奶顯著降低了仔豬胃腸道的大腸桿菌等細(xì)菌數(shù)量,從而證明該轉(zhuǎn)有人溶菌酶基因的山羊奶可以用于預(yù)防嬰幼兒腹瀉等疾病,2009年在美國(guó)上市。

截至目前,全世界從事乳腺生物反應(yīng)器商業(yè)化開(kāi)發(fā)的公司已有 10多家,表達(dá)水平可以進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)的藥物有近 40種[20],見(jiàn)表 1。

表 1 目前部分已投放市場(chǎng)或正在開(kāi)發(fā)的生物技術(shù)藥物

8 結(jié)語(yǔ)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究自問(wèn)世以來(lái),經(jīng)過(guò)世界各國(guó)科學(xué)家們的不懈努力,已經(jīng)取得了輝煌的成就。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物帶來(lái)的不僅僅是一種全新的藥物生產(chǎn)模式,而且還為人類(lèi)社會(huì)帶來(lái)了新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。據(jù)美國(guó)紅十字會(huì)和遺傳學(xué)會(huì)預(yù)測(cè):到 2010年,動(dòng)物乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)的藥物將占所有基因工程藥物的 95%,成為具有高額利潤(rùn)的新型產(chǎn)業(yè)。

作為一個(gè)新生產(chǎn)業(yè),轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展過(guò)程可能存在著一定的問(wèn)題,但無(wú)可否認(rèn),轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),隨著理論和技術(shù)的不斷完善,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其相關(guān)產(chǎn)品必將進(jìn)入真正的產(chǎn)業(yè)化和市場(chǎng)化階段,對(duì)人類(lèi)的生產(chǎn)和發(fā)展起著推動(dòng)性的作用。

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