王曉梅,趙衛(wèi)星,常軍林,劉 莎,房 咪

(1.寶雞文理學(xué)院化學(xué)化工系,陜西寶雞 721013;2.陜西省植物化學(xué)重點實驗室,陜西寶雞 721013;3.寶雞市中醫(yī)醫(yī)院,陜西 寶雞 721004)

老龍皮[1],別名:石龍皮、石龍衣、癩肚皮、蛇皮苔、石花。為地衣類牛皮葉科肺衣屬植物光肺衣Lobaria kurokavaeYosh im,以葉狀體入藥。生于山區(qū)的樹干基部、樹皮表面、巖石表面或土表。主要用于消化不良,小兒疳積,腎炎水腫,腹水,皮膚瘙癢;外用治燒燙傷,瘡瘍腫毒 (《全國中草藥匯編》)。老龍皮作為地方性藥材,廣泛地被秦嶺當(dāng)?shù)氐娜嗣袼鶓?yīng)用,但是,有關(guān)老龍皮的研究卻少有報道。氨基酸是生物體內(nèi)的生物大分子之一,是構(gòu)成動物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。根據(jù)報道[2,3]及我們前期所作的實驗,發(fā)現(xiàn)老龍皮中含有氨基酸、地衣酸、皂苷類和多糖類物質(zhì)。本實驗首次就老龍皮氨基酸的提取進(jìn)行了研究與探討,以期為老龍皮藥材的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

老龍皮購自秦嶺太白山區(qū),經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院胡本祥教授鑒定為牛皮葉科植物光肺衣 Lobaria kurokavaeYosh im的干燥地衣體。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器

BS-244-SS電子天平 (賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 (天津市泰斯特儀器有限公司);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);R-1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城工科股份有限公司);ZDHW調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);SP-752紫外 -可見分光光度計 (上海圣科儀器設(shè)備公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定波長的選擇[4]

(1)配制 0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn) L-酪氨酸溶液。

(2)樣品的制備。稱取研細(xì)的老龍皮 5 g,用70%乙醇,按料液比 (W/V)1∶11,于 75℃回流 2 h,提取 2次,合并 2次濾液,將溶劑蒸干后用雙蒸水定容于 50 mL容量瓶中備用。

分別取標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液各 1 mL加入 2%茚三酮溶液 1 mL和磷酸鹽緩沖液 2 mL,搖勻后于水浴加熱 15 min,取出,冷卻,用蒸餾水定容至 50 mL。再取 1 mL樣品溶液稀釋至 8 mL,在紫外 -可見分光光度計中進(jìn)行波長掃描,每種液體平行做 3次,取平均值。結(jié)果顯示對照品溶液和樣品溶液在 570 nm處均有最大吸收。所以,選擇 570 nm為本試驗的最佳測定波長。由朗伯 -比爾定律計算氨基酸含量,并計算提取率。

2.2 單因素選擇實驗

2.2.1 提取溶劑濃度的選擇

稱取研細(xì)的老龍皮 5 g,分別用 50%、60%、70%、80%、95%的乙醇 ,按料液比 (W/V)1∶11,于70℃回流提取 2次,每次 2 h,合并 2次濾液,將溶劑蒸干。按 2.1節(jié)方法顯色定容后,于 570 nm測吸光度A,并計算總氨基酸的提取率。數(shù)據(jù)分析得圖1:

圖1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由結(jié)果可見乙醇濃度 60%時,樣品提取測得的吸光值最大,總氨基酸提取率最高,而濃度小于和大于 60%時則提取率低,可能是因為濃度偏低時樣品中非極性氨基酸溶出量少,反之,濃度過高則降低極性氨基酸的溶出,因此以 60%的乙醇為最佳提取濃度。

2.2.2 料液比的選擇

稱取研細(xì)的老龍皮 5 g,用 70%的乙醇,于70 ℃,分別按料液比 (W/V)為 1∶10、1∶12.5、1∶15、1∶17.5、1∶20、1∶22.5回流提取 2次 ,每次 2 h,合并兩次濾液,將溶劑蒸干,按 2.1節(jié)方法顯色定容后,于 570 nm測吸光度 A,并計算總氨基酸的提取率如圖2。結(jié)果顯示,當(dāng)料液比為 1∶20時,樣品提取物測得的吸光值最大,總氨基酸提取率最高,因此以1:20為最佳料液比。

圖2 料液比的影響

2.2.3 提取時間的選擇

稱取研細(xì)的老龍皮 5 g,用 70%的乙醇,于70 ℃,按料液比 (W/V)1∶11,分別回流 2 h、3 h、4 h、5 h,每個時間提取 2次,合并兩次濾液,將溶劑蒸干,按 2.1節(jié)方法顯色定容后,于 570 nm測吸光度A,并計算總氨基酸的提取率如圖3。

圖3 提取時間的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取時間 3 h,樣品提取測得的吸光值最大,總氨基酸含量最多,2 h時提取量稍偏低,而在 3 h后隨著提取時間的增長,氨基酸提取量減少,可能是因為在較高的溫度下,時間越長,乙醇揮發(fā)量越多,同時氨基酸被氧化分解的量越多。因此以 3 h為最佳提取時間。

2.2.4 提取溫度的選擇

稱取研細(xì)的老龍皮 5 g,用 70%的乙醇,按料液比 (W/V)1∶11,分別于 50℃、60℃、70℃、80℃、95℃下回流提取 2次,每次 2 h,合并 2次濾液,將溶劑蒸干,按 2.1節(jié)方法顯色定容后,于 570 nm測吸光度 A,并計算總氨基酸的提取率如圖4。

圖4 提取溫度的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)從 50℃開始,隨溫度升高而提取率增高,當(dāng)提取溫度達(dá) 70℃時,樣品提取測得的吸光值最大,總氨基酸含量最多,而溫度升至 80℃及 95℃時,提取量明顯降低,原因可能是在 70℃以下時,隨著溫度的升高,氨基酸由藥材中溶出的量越多,而在較高溫度下乙醇揮發(fā)速度加快,使溶劑的乙醇濃度迅速降低而影響了氨基酸的溶出,因此以 70℃為最佳提取溫度。

2.3 最佳提取條件的確定

在單因素試驗的基礎(chǔ)上,對老龍皮提取總氨基酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,選用 L9(34)正交試驗表安排試驗,選擇乙醇濃度 (A)、料液比 (B)、提取時間(C)、提取溫度 (D)4個因素,每個因素選擇 3個水平,確立因素水平表1。結(jié)果見表2。

表1 氨基酸提取正交因素及水平設(shè)計

表2 氨基酸提取的正交試驗結(jié)果及分析

正交實驗結(jié)果 (表2)表明,老龍皮總氨基酸提取最佳條件組合為A2B3C2D2,即提取最佳條件采用60%乙醇作提取溶劑,料液比 (W/V)為 1∶20,在70℃提取 3 h,總氨基酸得率最高。料液比對總氨基酸提取率影響最大,4種因素對提取結(jié)果影響大小依次為:料液比 (B)>乙醇濃度 (A)>提取時間(C)>提取溫度 (D)。優(yōu)化實驗條件后重復(fù)實驗,提取總氨基酸的量可達(dá) 4.07%。

3 結(jié) 論

本研究通過單因素實驗分別考察了提取溶劑濃度、料液比、提取溫度和提取時間對提取率的影響,通過設(shè)計正交實驗,優(yōu)選出最佳提取工藝條件:乙醇濃度 60%,料液比 (W/V)1∶20,提取溫度 70℃,提取時間 3 h。本次實驗優(yōu)選出來的實驗條件,對今后開發(fā)利用老龍皮總氨基酸具有重要意義。

[1] 崔桂友,段 海.中國食用地衣種類的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)研究,2000,21(3):59-62.

[2] 靳菊情,丁東寧,邊曉麗,等.老龍皮多糖的研究 [J].中藥材,1997(7):355-357.

[3] 吳玫涵,馬劍文.老龍皮的氣相色譜 -質(zhì)譜分析[J].中國藥學(xué)雜志,1996(10):29-30.

[4] 梁英麗,李 艷,高孟婷,等.西歸中總氨基酸含量測定方法研究[J].大理學(xué)院學(xué)報,2009,8(10):7-9.