孔祥虹 何 強(qiáng) 郝少莉

(1.陜西師范大學(xué)，西安 710062; 2.陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局，西安 710068； 3. 陜西省農(nóng)業(yè)工程勘察設(shè)計(jì)院，西安 710068)

蘋果多酚是蘋果中所含多元酚類物質(zhì)的通稱，是果實(shí)在生長(zhǎng)發(fā)育期間的次生代謝產(chǎn)物。蘋果多酚與新鮮蘋果及其加工制品(如蘋果汁、蘋果酒等)的色澤、風(fēng)味及穩(wěn)定性密切相關(guān)[1,2]。蘋果多酚是蘋果中具有重要生理和藥理作用的主要成分之一, 蘋果多酚具有抗氧化、清除自由基、降血脂、降血壓、預(yù)防心血管疾病、抗突變、抗輻射、抗癌防癌、抑菌、防齲之功效[3,4]。

近年來(lái)，有關(guān)蘋果及蘋果汁中多酚的檢測(cè)有不少報(bào)道，吳燕華等[5]采用高效液相色譜法測(cè)定了蘋果中10種多酚，但未給出檢出限，無(wú)法了解該方法的靈敏度。其它報(bào)道也多采用反相高效液相色譜法[6-9]，但檢測(cè)的多酚種類未超過(guò)9種，而同時(shí)分離濃縮蘋果汁中10種酚類物質(zhì)檢測(cè)方法未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

筆者建立了反相高效液相色譜同時(shí)測(cè)定濃縮蘋果汁中10種多酚的方法，該法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠的特點(diǎn)，可為濃縮蘋果汁的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)及打擊果汁摻假[10]提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1100型，配有Agilent 1100VWD可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；

反式肉桂酸、根皮素、二羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、鄰香豆酸、阿魏酸、槲皮素、異槲皮素：均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；

甲醇、乙腈：色譜純；

乙酸(0.45 μm膜過(guò)濾)、乙酸乙酯：分析純；

濃縮蘋果汁：陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司渭南分公司；

反式肉桂酸、對(duì)香豆酸、二羥基苯甲酸、鄰香豆酸、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度均為1.0 mg/mL，分別精確稱取反式肉桂酸、對(duì)香豆酸、二羥基苯甲酸、鄰香豆酸、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品0.0250 g，用甲醇定容至25 mL；

根皮素、咖啡酸、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度均為1.0 mg/mL，分別稱取根皮素、咖啡酸、阿魏酸0.0100 g，用甲醇定容至10 mL；

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：10 mg/mL，稱取綠原酸0.050 0 g，用甲醇定容至5 mL；

異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.5 mg/mL，稱取異槲皮素0.002 5 g，用甲醇定容至5 mL；

10種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液：分別移取二羥基苯甲酸、對(duì)香豆酸200 μL，綠原酸1.50 mL，咖啡酸700 μL，反式肉桂酸、阿魏酸、鄰香豆酸、根皮素、槲皮素、異槲皮素100 μL于10 mL容量瓶中混合并用甲醇定容。

1.2 樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取果汁10.00 g，加水約10 mL(以溶解其中的高糖利于多酚的萃取)，搖勻，加入30 mL乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至2.00 mL。用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)色譜柱。

1.3 色譜條件

色譜柱：Insertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm, 5 μm)美國(guó)Agilent公司；10種單酚的色譜條件為流動(dòng)相C：乙腈-0.5%乙酸(體積比1∶1)；流動(dòng)相D：2%乙酸，梯度條件：0～55 min, C從10%升為55%，相應(yīng)D由90%降為45%；55～60 min， C從55%升為100%，相應(yīng)D由45%降為0%；60～65 min， C從100%降為30%，相應(yīng)D由0%升為70%；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)分析各單酚在紫外區(qū)域吸收情況得知，該8種單酚在280 nm下均有較大吸收，所以最終確定本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

2.2 流動(dòng)相及其流速的選擇

經(jīng)查閱資料及實(shí)驗(yàn)總結(jié)，實(shí)驗(yàn)采用乙腈-0.5%乙酸水溶液(體積比為1∶1)和2%乙酸水溶液為流動(dòng)相。由于所測(cè)多酚種類較多，極性有差異，流動(dòng)相僅采用一種比例無(wú)法將所有多酚達(dá)到較好分離，故采用梯度洗脫。最終確定洗脫程序?yàn)椋?～55 min，乙腈-0.5%乙酸用量(體積分?jǐn)?shù))從10%升為55%，相應(yīng)2%乙酸體積用量由90%降為45%；55～60 min，乙腈-0.5%乙酸用量從55%升為100%，相應(yīng)2%乙酸由45%降為0%；60～65 min，乙腈-0.5%乙酸從100%降為30%，相應(yīng)2%乙酸由0升為70%。

對(duì)流動(dòng)相流速進(jìn)行試驗(yàn)，得知流速過(guò)高，分離效果較差，但流速過(guò)低又會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。綜合考慮確定流動(dòng)相流速為0.8 mL/min。

2.3 柱溫的選擇

設(shè)定柱溫為25、35、40℃，分別進(jìn)樣進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，隨著柱溫升高分離度變大，分析時(shí)間縮短，但是柱溫太高會(huì)損壞色譜柱，當(dāng)溫度為35℃時(shí)分離度已完全達(dá)到要求，因此最終確定柱溫為35℃。

2.4 定性分析

將10種單酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.3色譜條件下進(jìn)樣分析，色譜如圖1所示。由圖1可知，二羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、異槲皮素、鄰香豆酸、反式肉桂酸、槲皮素、根皮素保留時(shí)間分別為：12.970、22.171、25.351、35.252、39.045、42.500、47.320、61.893、62.232、63.791 min。

圖1 10種單酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

利用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)稀釋配制成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在已確定的色譜條件下進(jìn)樣分析，然后根據(jù)色譜峰面積和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量關(guān)系進(jìn)行線性回歸。

將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，依次進(jìn)樣10 μL，當(dāng)信噪比等于3時(shí)所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為檢出限。

各組分的線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限列于表1。由表1可知，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 3，表明線性關(guān)系良好，滿足定量分析的要求。

表1 各酚標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

注：x—標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量，mg/L；y—標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)應(yīng)的峰面積。

2.6 回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)

在濃縮蘋果汁樣品中分別加入混標(biāo)溶液1.0 mL，按照1.2方法進(jìn)行處理,在1.3色譜條件下進(jìn)樣分析。根據(jù)實(shí)際測(cè)定值計(jì)算回收率，重復(fù)5次進(jìn)樣進(jìn)行精密度試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各酚的回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.7 樣品測(cè)定

將樣品的HPLC圖譜與圖1比較對(duì)其進(jìn)行定性分析，樣品中各酚類物質(zhì)的含量以峰面積查相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得，結(jié)果列于表3。

表3 濃縮蘋果汁中各酚含量 mg/kg

由表3可以看出，濃縮蘋果汁中主要多酚物質(zhì)為二羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、異槲皮素、鄰香豆酸、槲皮素，且酸性酚含量高于中性酚，綠原酸含量最高。

3 結(jié)論

(1)采用乙腈溶液和乙酸溶液為流動(dòng)相，選擇適宜的檢測(cè)波長(zhǎng)，通過(guò)調(diào)節(jié)流速、柱溫等參數(shù)，可以較好地實(shí)現(xiàn)濃縮蘋果汁中主要多酚物質(zhì)的分離，各酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的線性，能夠用于定量分析。建立的方法具有較高的靈敏度和精密度，各酚的回收率均在85%以上，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠。

(2)濃縮蘋果汁中主要的多酚物質(zhì)為二羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、異槲皮素、鄰香豆酸、槲皮素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為濃縮蘋果汁的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)及功能成分研究提供參考。

[1] Schobinger U,Barbic I,Duerr P,et al.Phenolic compounds in apple juice-positie and negative effects[J].Fruit Processing,1995,5(6):171-172.

[2] 郝慧英，趙光鰲．蘋果酒中多酚及其褐變[J]．釀酒，2002,29(2):63-65.

[3] 唐傳核,彭志英. 蘋果多酚的開發(fā)與應(yīng)用[J].中國(guó)食品添加劑,2001(2): 41-45.

[4] 徐亞民. 天然抗氧化劑—蘋果多酚的研究與應(yīng)用[C].第十屆中國(guó)國(guó)際食品添加劑和配料展覽會(huì)學(xué)術(shù)論文集.上海：2006.

[5] 吳燕華,劉文力，閻紅,等．高效液相色譜法測(cè)定蘋果中的酚類物質(zhì)[J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào),2002(7)：826-828.

[6] 孫承鋒，姜竹茂，楊建榮.反相高效液相色譜法測(cè)定蘋果多酚的含量[J].食品工業(yè)科技，2006，27(4)：185-191.

[7] 孫海峰，呂海濤，周莎莎,等.HPLC法測(cè)定蘋果濃縮汁中的多酚類物質(zhì)[J].食品科學(xué)，2008，29(4)：314-317.

[8] 楊建榮，孫承鋒.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蘋果中9種多酚物質(zhì)[J].食品與機(jī)械，2008，24(1)：127-129.

[9] 李學(xué)鵬，勵(lì)建榮，楊建榮.蘋果中多酚類物質(zhì)HPLC檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2008，8(6)：116-121.

[10] Andreas Schieber,Petra Keller,Reinhold Carle.Determinaion of phenolic acids and flavonoids of apple and pear by high-performance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography A,2001:265-273.