高 文 徐永健 劉先勝

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院呼吸內科,武漢,430030)

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種嚴重危害人類健康的疾病,其發(fā)病率和死亡率有逐年增加的趨勢。據報道,1990年COPD為全球第六位死亡原因,預言到2020年將成為全球第三位致死原因和世界經濟負擔的第五位[1]。

吸煙是目前公認的COPD的最重要的誘因,但是在吸煙者中,僅有15%-20%的人最終會發(fā)展為COPD,這說明在吸煙是否患COPD的發(fā)病過程中,存在個體易感性差異 (如遺傳因素等)。對于COPD患者,目前尚無有效的阻止病程進展或根治的方法,預防就顯得尤為重要。因此,探討COPD的易感因素和發(fā)病機制,對前瞻性地尋找COPD易患個體以及阻斷COPD的發(fā)生有重要意義。

白介素-18(interleukin-18)是1995年才發(fā)現的一種細胞因子,最初因其能誘導 T淋巴細胞產生γ干擾素 (IFN-γ),曾一度被稱為γ干擾素誘生因子 (IGIF),后來隨著研究的進展,發(fā)現它具有多種生物學活性。除了誘導 IFN-γ產生外,還能促進N K細胞的活化與增殖、參與 Th1型免疫反應、增強巨嗤細胞的殺傷活性等,與多種慢性炎癥疾病 (如類風濕性關節(jié)炎[7]、狼瘡性腎炎[17]、克羅恩病[18])有關。提示 IL-18是一個多向性促炎癥因子和重要的免疫調節(jié)因子。

近年對慢性肺部炎癥疾病 (如特發(fā)性肺纖維化、COPD)的研究發(fā)現其與細胞因子的調節(jié)關系密切。有研究報道,COPD患者血清中和誘導痰中的IL-18水平要明顯高于無COPD者。但是對人肺組織中IL-18表達的研究很少,并且吸煙是否可以影響肺內IL-18的水平尚不清楚。本實驗探討吸煙患COPD者與不患COPD者肺組織中IL-18表達水平差異,為前瞻性識別吸煙人群中COPD易患個體提供研究資料。

材料和方法

1.材 料

肺組織來源于我院心胸外科2008年11月至2009年2月因肺癌行肺葉切除的30例患者。其中不吸煙不患COPD者10例 (Control組),吸煙不患COPD患者10例 (Smoker組)和吸煙患COPD患者10例 (COPD組)。入選病例均不合并其他慢性肺部疾病,如哮喘、支氣管擴張和間質性肺疾病,無心臟病、肝衰竭、腎衰竭等慢性系統(tǒng)性病變。所有病例術前一周內均行肺功能檢查。COPD的診斷依據中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組制定的《慢性阻塞性肺疾病診療指南》[8],入選的COPD患者均處于穩(wěn)定期。

2.標 本采集

實驗所用的肺組織取自盡量遠離肺癌病灶(5cm以上),肉眼觀察無肺癌浸潤的外周肺組織。手術取下肺組織標本,迅速用10%福爾馬林充分浸泡固定12h,常規(guī)梯度酒精脫水,石蠟包埋。

3.H E染色

取上述人肺組織石蠟塊,切片 (5μm),HE染色鏡下觀察各組肺組織形態(tài)學變化。

4.免 疫組化染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,兔抗人IL-18多克隆抗體 (北京博奧森公司)作為一抗,稀釋度為1:200。以PBS代替一抗作陰性對照。采用免疫細胞化學SP法,DAB顯色,蘇木素復染細胞核,中性樹膠封片。

5.結 果判斷

細胞漿內有棕黃色細顆粒為陽性染色細胞,觀察陽性細胞表達部位。采用 HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)分析圖像,在顯微鏡下以相同外部條件 (亮度)攝取bmp圖像。每張片子隨機在顯微鏡下于上、下、左、右、中位置選取5個視野 (100倍放大),測定陽性細胞平均光密度值 (A值),以表示肺組織中IL-18表達的相對量。

6.統(tǒng) 計學方法

實驗結果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數數據用χ2檢驗,計量數據以均數±標準差 (ˉx±s)表示,組間差異顯著性比較采用 F檢驗,組間兩兩比較采用q檢驗,P<0.05為差異有顯著性。對30例患者肺組織IL-18平均光密度值與肺功能指標 FEV1/FVC和 FEV1(%pred)之間的關系采用直線相關性分析。

結 果

1.各 組患者臨床資料比較

Control、Smoker、COPD三組之間比較,性別、年齡之間差異無顯著性意義 (P>0.05)。Smoker組和COPD組吸煙指數之間差異無顯著性意義 (P>0.05)。COPD 組 FEV1(%pred)、FEV1/FVC均降低,與Control組和 Smoker組比較差異均有顯著性意義 (P<0.01),而Smoker組和Control組之間比較差異均無顯著性意義 (P>0.05)(見表 1)。

表1 3組患者基本情況和肺功能比較 (ˉx±s)Table 1 General characteristics and pulmonary function measurements of 3 groups(ˉx ±s)

2.肺 組織的形態(tài)學改變 (HE染色)

不吸煙不患COPD組 (Control組)與吸煙不患COPD(Smoker組)肺組織切片均無明顯炎癥變化,表現為肺泡結構完整,大小較一致,肺泡壁薄,無明顯充血、出血,肺泡腔內炎性細胞少見。支氣管粘膜皺襞完整,管腔內無滲出物,管壁及周圍炎性細胞很少見,見圖1a、1d、1b、1e。吸煙患COPD組 (COPD組)呈顯著炎癥變化,可見肺泡中度擴張,肺泡壁有明顯斷裂,肺泡腔內有大量炎癥細胞。外周氣道平滑肌明顯增厚,管腔內亦有大量炎癥細胞浸潤,有粘液栓形成。見圖1c、1f。

3.肺 組織IL-18的表達 (免疫組化SP法)

3.1 顯微鏡下觀察IL-18的表達

IL-18陽性著色定位于細胞質。染色陽性信號為棕黃色顆粒。三組肺組織IL-18免疫組化染色圖像如下 (Control組 2a、2d,Smoker組 3b、2e,COPD組2c、2f)。鏡下可觀察到 IL-18主要表達于單核-巨嗤細胞、淋巴細胞等的胞漿中,肺泡上皮細胞、細支氣管上皮細胞及小血管內皮細胞中也可見到陽性表達。

3.2 IL-18表達的半定量分析

對肺組織IL-18表達的免疫組化圖像進行平均光密度 (average optical density ,AOD)測定(具體結果見表2)。COPD組和Smoker組肺組織IL-18的表達量均增加,與Control組比較差異均有顯著性意義 (分別 P<0.01,P<0.05);COPD組與Smoker組比較,差異有顯著性意義 (P<0.01)。

表2 各組肺組織 IL-18的表達 (AOD值)(ˉx±s)Table 2 The comparison of theAOD values of IL-18 in pulmonary tissues of 3 groups

3.3 肺組織中 IL-18的表達與 FEV1/FVC和FEV1(Pred%)的關系

將三組病人綜合起來,分析肺組織IL-18平均光密度值與反應氣流受限的肺功能指標 FEV1/FVC和FEV1(Pred%)之間的關系,發(fā)現肺組織中IL-18的表達量 (用AOD表示)與 FEV1/FVC和FEV1(Pred%)呈顯著的負的直線相關關系(分別 n=30,r=-0.778,P<0.01和 n=30,r=-0.520,P<0.01)。隨著肺內IL-18表達量的增加,FEV1/FVC和FEV1(Pred%)逐漸降低。

討 論

長期吸煙是現在已知的COPD的最重要的誘因。吸煙可以引起多種炎癥細胞聚集在肺中,通過蛋白水解酶-抗蛋白水解酶體系失衡,氧化應激,以及凋亡機制,導致慢性氣道炎癥[2]。Kang MJ通過對轉基因小鼠的研究發(fā)現,吸煙在野生型小鼠可以誘導肺部炎癥和肺氣腫的發(fā)生,但是在 IL-18Rα基因缺乏小鼠,這一作用就大大降低。提示IL-18/IL-18Rα通路在吸煙誘導的肺氣腫中可能起關鍵作用[5]。

成熟的IL-18作為一種炎性細胞因子,已經有實驗證明其表達在老鼠致命性的肺部損傷[4]和人類的特發(fā)性肺纖維化[6]的發(fā)病過程中起了重要作用。近年對慢性肺部炎癥疾病的研究發(fā)現,IL-18與細胞因子的調節(jié)關系密切,在肺慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。有研究發(fā)現,COPD患者誘導痰中的 IL-18水平要明顯高于無COPD者[16]。Peterse AM等[9]報道COPD患者血清中和骨骼肌中IL-18mRNA的表達較正常人明顯增加,提出IL-18可能參與COPD惡病質的形成的觀點。Hoshino T[3]通過對肺內過表達 IL-18的轉基因小鼠的研究發(fā)現,IL-18在肺內表達增加,可導致嚴重的肺氣腫改變。

在本課題中,我們發(fā)現IL-18在肺組織中主要表達在肺泡內和氣道內的巨嗤細胞和淋巴細胞中,在肺泡上皮,小血管內皮細胞以及氣道上皮細胞等也可見到表達。在無COPD組的肺組織中,IL-18的表達很少,相反的,在COPD患者的肺組織中,炎性細胞大大增加,同時IL-18在各種細胞中的表達也明顯增多,提示 IL-18可能通過參與炎癥反應,促進COPD的病理發(fā)展。對于吸煙是否對肺內IL-18的水平產生影響,我們運用免疫組化染色技術,對IL-18的表達進行半定量測定。組間比較顯示,吸煙患COPD組肺組織內IL-18的表達較吸煙不患COPD組和不吸煙對照組明顯增加。此結果進一步支持了IL-18在COPD的病理過程中具有重要作用。并且IL-18在吸煙不患COPD者肺中的表達也較不吸煙對照組增高,提示吸煙可能通過增加IL-18的表達來促進 COPD的發(fā)生,這也驗證了Kang MJ[5]的IL-18/IL-18Rα通路在吸煙誘導的肺氣腫中起關鍵作用的結論。通過對肺組織中IL-18平均光密度值與肺功能指標 (FEV1/FVC和FEV1(%pred))進行相關性分析,我們發(fā)現隨著肺內IL-18的表達增加,肺部的氣流受限也逐漸進展,在是否吸煙、是否患COPD的病人中都呈現此趨勢。

對于IL-18參與COPD肺部損傷的機制,可能與其刺激IFN-γ產生、促進中性粒細胞和巨嗤細胞的聚集、誘導 Th1/Tc1配體分化、促進 T細胞和N K細胞成熟、參與復雜的細胞因子網絡[10-14],以及調節(jié)細胞凋亡[15]有關。但對于 IL-18在COPD患者肺中產生增加,是疾病直接導致,還是由于其它細胞因子作用的繼發(fā)產生,現在還不得知。

總之,COPD的發(fā)病機制非常復雜,IL-18參與其機制形成。同時本課題研究結果提示IL-18可能對前瞻性識別吸煙人群中COPD易感者有一定提示意義。

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圖 版 說 明

圖1a Control組肺組織,HE染色 ×100

圖1b Smoker組肺組織,HE染色?！?00

圖1c COPD組肺組織,HE染色。×100

圖1d Control組肺組織外周氣道,HE染色?！?00

圖1e Smoker組肺組織外周氣道,HE染色?！?00

圖1f COPD組肺組織外周氣道,HE染色?！?00

圖2a IL-18在Control組肺組織中的表達。S-P法,×200

圖2b IL-18在Smoker組肺組織中的表達。S-P法,×200

圖2c IL-18在COPD組肺組織中的表達。S-P法,×200

圖2d IL-18在Control組肺組織外周氣道中的表達。S-P法,×200

圖2e IL-18在Smoker組肺組織外周氣道中的表達。S-P法,×200

圖2f IL-18在COPD組肺組織外周氣道中的表達。S-P法,×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig 1a Pulmonary tissue of control group.HE staining ×100

Fig1b Pulmonary tissue of smoker group.HE staining ×100

Fig1c Pulmonary tissue of COPD group.HE staining ×100

Fig1d Pulmonary peripheral airways of control group.HE staining×100

Fig1e Pulmonary peripheral airways of smoker group.HE staining×100

Fig1f Pulmonary peripheral airways of COPD group.HE staining×100

Fig2a The expression of IL-18 in pulmonary tissue of control group.SP method×200

Fig2b The expression ofIL-18 in pulmonary tissue of smoker group.SP method×200

Fig2c The expression of IL-18 in pulmonary tissue of COPD group.SP method×200

Fig2d The expression of IL-18 in pulmonary peripheral airway of control group.SP method×200

Fig2e The expression of IL-18 in pulmonary peripheral airway of smoler group.SP method×200

Fig2f The expression of IL-18 in pulmonary peripheral airway of COPD group.SP method×200