康筱玲,李 偉,冉志遠(yuǎn)

隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,免疫脫落細(xì)胞學(xué)在臨床病理診斷中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。但在常規(guī)的脫落細(xì)胞學(xué)檢查中,常因免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性率低、非特異性著色等問(wèn)題,導(dǎo)致免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果不夠理想。表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚(T riton X-100)的應(yīng)用,可以使免疫細(xì)胞化學(xué)染色的陽(yáng)性率大大提高,且其非特異性著色顯著降低,有利于陽(yáng)性結(jié)果的判斷,并且節(jié)約抗體,現(xiàn)將具體方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 病例采集 收集海軍總醫(yī)院病理科2007-2009年經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)檢查確診為惡性胸水及惡性腹水標(biāo)本共27例,標(biāo)本及時(shí)離心,固定制成涂片,95%乙醇中備用。

1.2 試劑 Triton X-100溶液,實(shí)驗(yàn)用第一抗體測(cè)定增殖細(xì)胞核相關(guān)抗原(ki-67)、癌胚抗原(CEA)、白細(xì)胞共同抗原(LCA)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 質(zhì)量分?jǐn)?shù) Triton X-100溶液用0.01 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)配制成1%及0.3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液。

1.4 抗體稀釋 ki-67為1∶100,CEA為1∶100,LCA 為1∶100。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 分組 27例胸腹水標(biāo)本隨機(jī)分為A、B、C組,A組滴入ki-67,B組滴入CEA,C組滴入LCA。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 預(yù)處理 涂片蒸餾水沖洗3次,A、B組浸泡于1%T riton X-100 20 min,C組浸泡于PBS 20 min,PBS沖洗3次。

2.2.2 消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 3%H2O2溶液浸泡涂片10 min,PBS沖洗3次。

2.2.3 修復(fù) pH 6.0枸櫞酸鹽修復(fù)液,高壓鍋修復(fù)2.5 min,PBS沖洗3次。

2.2.4 滴加一抗 A、C組加入一抗,B組加入比例為2∶1的一抗與0.3%Triton X-100混合液。

2.2.5 孵育 37℃溫箱孵育2 h,PBS沖洗3次。

2.2.6 加入二抗 3組加入通用型二抗,37℃溫箱孵育30 min,PBS沖洗3次。

2.2.7 顯色 3,3-二氨黃聯(lián)苯胺(diaminobe nzidine,DAB)顯色。

蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 判斷標(biāo)準(zhǔn) ki-67以細(xì)胞核染成棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性。CEA以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿染成棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性。LCA以細(xì)胞膜染成棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性。

3.2 結(jié)果判讀 A組與B組相比,細(xì)胞的陽(yáng)性率表達(dá)基本一致,但B組較A組背景明顯清晰,且特異性著色深。C組細(xì)胞陽(yáng)性率明顯低于A、B組。B組細(xì)胞之間排列較A組及C組整齊,且沒(méi)有成團(tuán)簇?fù)淼默F(xiàn)象。

4 討論

脫落細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)與組織切片相比,有標(biāo)本新鮮、操作方便快捷、勿需石蠟高溫處理及細(xì)胞抗原性保存較好的優(yōu)點(diǎn),可在實(shí)際工作中應(yīng)用[1]。但其缺點(diǎn)是細(xì)胞離心或涂片后黏著度較差、易掉片、非特異性沾染強(qiáng)、涂片面積大、耗費(fèi)試劑多及標(biāo)本制作重復(fù)性差等,不像免疫組織化學(xué)那樣常規(guī)開(kāi)展[2]。脫落細(xì)胞胞膜較完整,抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)速度較慢,脫落細(xì)胞抗體作用時(shí)間較組織切片時(shí)間長(zhǎng),因此脫落細(xì)胞免疫組化要求的抗體濃度比組織切片相比要高[3]。T riton X-100是一種表面活性劑,能溶解脂質(zhì),增加細(xì)胞膜的通透性,有利于抗體較快深入細(xì)胞內(nèi)部,從而縮短抗體作用時(shí)間并能增強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞染色結(jié)果。將涂片泡在T riton X-100溶液中進(jìn)行預(yù)處理,并在滴加一抗時(shí)在抗體中混入低濃度的T riton X-100溶液,既能增加涂片中陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),減少非特異性著色、降低背景,又能節(jié)省抗體,是一種較好的脫落細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)方法。

[1]張智慧,孫耘田.免疫細(xì)胞化學(xué)在細(xì)胞病理學(xué)中的應(yīng)用[J].中華病理學(xué)雜志,2005,34(10):672-673.

[2]熊正文,王伯法,史景泉,等.微波修復(fù)抗原技術(shù)在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,1998,14(2),177-179.

[3]潘琳,高福云,郭艷茹.脫落細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)[J].中華病理學(xué)雜志,2007,36(7):491-493.