亢 涵，李 楠，任南琪

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150090，rnq@hit.edu.cn)

強(qiáng)化生物除磷(EBPR)技術(shù)利用微生物高效去除污水中的磷酸鹽，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于污水處理廠中.聚磷菌和聚糖菌是存在于強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)(EBPR)中的競爭菌.聚磷菌在厭氧階段分解體內(nèi) polyP釋放能量來吸收底物合成體內(nèi)的PHAs儲備，在好氧階段分解體內(nèi)的PHAs，釋放能量吸收磷酸鹽合成體內(nèi)polyP［1］.聚糖菌與聚磷菌不同之處在于，厭氧階段分解體內(nèi)糖原釋放能量，用來吸收底物合成PHAs，在好氧階段分解體內(nèi)的PHAs釋放能量合成糖原［2］.為了讓反應(yīng)器取得更好的除磷效果，前人研究了EBPR系統(tǒng)的影響因素.Zhang等發(fā)現(xiàn)當(dāng) pH從7.0降到6.5時(shí)，反應(yīng)器除磷能力降低［3］.Serafim等發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH從7.0增加到8.5時(shí)，反應(yīng)器的除磷能力增加［4］. Oehmen等認(rèn)為丙酸比乙酸有利于提高EBPR系統(tǒng)的除磷效果，因?yàn)榫厶蔷毡崴俾市∮诰哿拙?］.Panswad等發(fā)現(xiàn)，溫度從20℃升到35℃時(shí)厭氧釋磷速率增加，但好養(yǎng)磷吸收速率降低，即使在20℃，反應(yīng)器中仍存在大量聚糖菌［6］.溶解氧(DO)也影響聚磷菌和聚糖菌的競爭［7］.

本研究在低溫下運(yùn)行了強(qiáng)化生物除磷反應(yīng)器，利用FISH技術(shù)監(jiān)測其中的聚磷菌和聚糖菌并將它們量化，研究其競爭關(guān)系及其對反應(yīng)器除磷效果的影響.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置與方法

試驗(yàn)采用有效容積為2 L的圓柱形有機(jī)玻璃反應(yīng)器，內(nèi)徑為10 cm，高度為35 cm.反應(yīng)器間歇式運(yùn)行，12 h一個(gè)周期.0～90 min厭氧攪拌(其中0～8 min進(jìn)水)，90～330 min好氧曝氣，沉降15 min，出水10 min，閑置5 min.溫度與DO用WTW DO測定儀監(jiān)測，控制反應(yīng)器內(nèi)溫度在(15± 2)℃，好氧階段溶解氧質(zhì)量濃度>2.0 mg·L-1.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

接種污泥取自哈爾濱文昌污水處理廠曝氣池，該污水廠采用傳統(tǒng)活性污泥法，污泥具有良好的有機(jī)物去除效果，除磷效率<30%.

實(shí)驗(yàn)用水采用人工配水，進(jìn)水的主要組成物質(zhì)與濃度為 CH3COONa·3H2O 4.69 mmol/L (COD為300 mg·L-1)，NH4Cl 1.79 mmol/L(ρN= 25 mg·L-1)，NaH2PO4·2H2O 0.32 mmol/L(ρP= 10 mg·L-1)，此外每升進(jìn)水中含有0.5 mL微量元素液:EDTA 100 mg·L-1，MgSO4·7H2O 20.6 g·L-1，CaCl25.6 g·L-1，MnSO4·H2O 0.14 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.7 g·L-1，CuCl2·2H2O 0.19 mg·L-1，ZnCl20.05 g·L-1，H3BO30.05 g·L-1.

1.3 取樣與水質(zhì)分析方法

為了考察反應(yīng)器啟動過程中聚磷菌的形態(tài)與數(shù)量以及與污染物處理效果的關(guān)系，分別在反應(yīng)器運(yùn)行第0，10，20，30，40，50，60 d取樣.取樣后離心分離混合液，上清液過濾后按照《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第三版)檢測COD，PO4

3-等水質(zhì)指標(biāo)，污泥部分立即固定用于FISH分析.

1.4 FISH分析

1.4.1 樣品的固定

污泥樣品在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛中4℃固定2 h，在PBS溶液中沖洗2次，懸浮于PBS-乙醇(體積比1∶1)溶液中，于-20℃保存.

1.4.2 熒光探針

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用16S rRNA探針如表1所示.

表1 實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的16S rRNA探針

1.4.3 原位雜交

將固定的樣品置于用明膠包背的載玻片上，風(fēng)干后于體積分?jǐn)?shù)分別為50%，80%，95%，100%的乙醇中各脫水3 min，風(fēng)干后等待雜交.污泥樣品在46℃雜交2.5 h，雜交液成分如下:0.9 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.01% SDS，體積分?jǐn)?shù)為20%(EUB388)和體積分?jǐn)?shù)為35%(PAOmix、DFmix、GAOsmix)去離子甲酰胺，pH 7.2.雜交后于48℃用洗液(40 mmol/L NaCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%SDS，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2)洗20 min，之后用蒸餾水洗去殘留洗液，自然風(fēng)干［12］.風(fēng)干后樣品用共聚焦顯微鏡 LSM 510 META(德國Zeiss公司)觀察，并用其配套軟件獲得聚磷菌數(shù)量在全菌數(shù)量中所占比例.

2 結(jié)果與分析

2.1 COD去除效果

圖1給出了反應(yīng)器COD去除效果.由圖可見，在反應(yīng)器運(yùn)行的60 d中，COD去除率平穩(wěn)，保持在95%左右.大部分COD在厭氧階段去除.0～20 d厭氧末期COD濃度變化較大，20 d之后趨于平穩(wěn).

圖1 反應(yīng)器COD的去除情況

2.2 磷酸鹽去除效果

圖2給出了低溫運(yùn)行的反應(yīng)器中磷的去除效果.由圖可見，初期磷酸鹽去除率不穩(wěn)定，20 d后，出水磷濃度逐漸降低，使磷酸鹽去除率持續(xù)上升，60 d時(shí)達(dá)到最大值86.89%.初期厭氧末期磷濃度波動較大，20 d后逐漸增加，45 d時(shí)達(dá)到最大值26.44 mg·L-1.50 d時(shí)突然降低，之后又再次升高.

圖2 反應(yīng)器磷酸鹽的去除情況

2.3 FISH原位檢測反應(yīng)器中聚糖菌

圖3分別為反應(yīng)器中聚磷菌和聚糖菌的雙雜交FISH圖片.圖3(a)為反應(yīng)器運(yùn)行50 d時(shí)反應(yīng)器中的聚磷菌FISH圖片.這張圖片中用到的雜交探針為FITC染料標(biāo)記的EUB338mix探針和CY3染料標(biāo)記的PAOmix探針，圖中的黃色熒光為雜交了這兩中探針的Rhodocyclus sp.，綠色熒光為只雜交了EUB338mix探針的菌.圖3(b)為反應(yīng)器運(yùn)行10 d時(shí)反應(yīng)器中的聚糖菌FISH圖片.這張圖片中用到的雜交探針為FITC染料標(biāo)記的EUB338mix探針、CY3染料標(biāo)記的PAOmix探針和CY5染料標(biāo)記的DFmix探針.圖中圓箭頭標(biāo)記的紅色熒光為雜交了GAOmix探針的Competibacter phosphatis(Gammaproteobacteria)，標(biāo)準(zhǔn)箭頭標(biāo)記的藍(lán)色熒光為雜交了DFmix探針的Defluviicoccus spp.(Alphaproteobacteria)，綠色為雜交了EUB338mix探針的菌.

圖3 反應(yīng)器中聚磷菌和聚糖菌的FISH圖片

2.4 聚糖菌含量

利用共聚焦顯微鏡配套軟件，可獲得聚磷菌在全菌中所占的數(shù)量比例(圖4).由圖可見，聚磷菌在全菌中的數(shù)量比例逐漸上升.30 d之前聚磷菌增長較快，數(shù)量從19.96%增加到33.13%. 30～50 d聚磷菌數(shù)量保持在33%左右，60 d時(shí)聚磷菌數(shù)量突然增加，達(dá)到最大值41.49%.0～30 d反應(yīng)器中的Alphaproteobacteria數(shù)量占全菌數(shù)量的比例由15.76%下降到3.1%，30～60 d保持在2.6%左右.Gammaproteobacteria數(shù)量逐漸上升，但在全菌數(shù)量中所占比例不高，最高為8.11%.

圖4 污泥中聚磷菌和聚糖菌占全菌的數(shù)量比例

3 討論

圖4(a)為聚磷菌50 d時(shí)的照片.此時(shí)反應(yīng)器的除磷率為75%.圖中聚磷菌菌體密集成團(tuán)，菌群面積較大.圖5中，此時(shí)聚磷菌占全菌的數(shù)量比例為35.1%，為0～50 d的最大值.圖4(b)為聚糖菌10 d時(shí)的照片.圖中藍(lán)色為Alphaproteobacteria，此時(shí)反應(yīng)器中Alphaproteobacteria數(shù)量較多，占全菌數(shù)量的14.24%，菌體呈現(xiàn)明顯的四聚體(TFOs)形態(tài)，且在污泥中分散存在.圖中紅色為Gammaproteobacteria，Gammaproteobacteria菌體為大球型，數(shù)量較少.

聚糖菌是強(qiáng)化生物除磷反應(yīng)器中聚磷菌的競爭菌.由圖5可以看出，0 d時(shí)Alphaproteobacteria的數(shù)量較多，達(dá)到了15.76%，與聚磷菌的數(shù)量19.96%比較接近，Gammaproteobacteria數(shù)量很少，為2.49%.低溫運(yùn)行了20 d后，聚磷菌的數(shù)量不斷增加，Alphaproteobacteria的數(shù)量不斷降低，而Gammaproteobacteria的數(shù)量在反應(yīng)器運(yùn)行期間一直保持增加，但是占全菌數(shù)量的比例較少，最高為8.11%.Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria都是聚磷菌的競爭菌，但Alphaproteobacteria的數(shù)量卻不斷下降，而Gammaproteobacteria的數(shù)量雖然較少，但仍保持增長.這種現(xiàn)象可以解釋為，低溫條件下聚磷菌更易獲得足夠底物合成體內(nèi)PHA用于生長繁殖;而Alphaproteobacteria在低溫下吸收底物合成PHA的速率降低，導(dǎo)致其數(shù)量的減少;對于Gammaproteobacteria，一方面受到低溫影響，一方面受到聚磷菌的數(shù)量優(yōu)勢的制約，其數(shù)量較少且增加緩慢.這與 Erdal等［13］和 Lopez-Vazquez［14］發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象相一致.

觀察圖2和3發(fā)現(xiàn)，與20 d以后的數(shù)據(jù)相比，20 d之前反應(yīng)器的各項(xiàng)指標(biāo)均不穩(wěn)定，這時(shí)是聚磷菌占據(jù)優(yōu)勢地位而聚糖菌逐漸被淘汰的調(diào)整階段.20～50 d，聚磷菌增長減緩，數(shù)量保持在33%左右，沒有了競爭菌的干擾，聚磷菌的除磷能力在逐漸增加.此時(shí)COD去除效果穩(wěn)定，磷酸鹽去除率持續(xù)上升，厭氧末期磷濃度在30 d之后保持穩(wěn)定，這與聚磷菌含量曲線相一致.這種現(xiàn)象說明，聚磷菌的數(shù)量決定了厭氧末期磷釋放量.

觀察50～60 d的厭氧末期磷濃度可以發(fā)現(xiàn)，50 d時(shí)雖然聚磷菌占全菌數(shù)量的比例沒變，但厭氧磷釋放減少，50 d后，隨著聚磷菌數(shù)量突然增加，厭氧磷釋放再次恢復(fù)，而整個(gè)過程中，COD去除率和厭氧末期COD濃度保持穩(wěn)定.這種現(xiàn)象可解釋為聚磷菌為了繁殖積累體內(nèi)的磷儲備，而減少厭氧釋磷量.亢涵等曾發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)器啟動階段，快速增殖的新生聚磷菌不能立刻行使除磷能力，要有一段“積累期”，形成 PHA和 polyP儲備［15］.而在本文的實(shí)驗(yàn)中，聚磷菌快速增殖之后的反應(yīng)器處理效果并沒有滯后.觀察亢涵等的聚磷菌數(shù)量比例曲線可以發(fā)現(xiàn)，聚磷菌的兩個(gè)增殖階段的菌體數(shù)量增長迅速，比如第一增殖階段聚磷菌占全菌數(shù)量比例在5 d內(nèi)增加了23.59%.短時(shí)間內(nèi)的大量增殖需要大量的PHA和polyP供給，因此出現(xiàn)了反應(yīng)器除磷效果延后的現(xiàn)象.在本文的實(shí)驗(yàn)中，50～60 d聚磷菌占全菌數(shù)量比例在5 d內(nèi)平均增加了3.2%，數(shù)量較少，對反應(yīng)器的處理效果沒有造成影響.

4 結(jié)論

1)強(qiáng)化生物除磷SBR反應(yīng)器在低溫下運(yùn)行了60 d.0～20 d反應(yīng)器的各項(xiàng)指標(biāo)不穩(wěn)定，這時(shí)反應(yīng)器中的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，聚磷菌和聚糖菌競爭優(yōu)勢地位.此階段為反應(yīng)器的調(diào)整階段，20 d后反應(yīng)器各項(xiàng)指標(biāo)逐漸穩(wěn)定，磷去除率增加.

2)在低溫運(yùn)行的反應(yīng)器中，0～20 d，低溫更有利于聚磷菌的生長繁殖，Alphaproteobacteria被淘汰.而Gammaproteobacteria受到溫度與聚磷菌的制約，占全菌數(shù)量比例最高為8.11%.

3)50～60 d聚磷菌出現(xiàn)了一個(gè)快速增殖階段，此時(shí)反應(yīng)器的處理效果沒有出現(xiàn)亢涵等所說的延遲現(xiàn)象.亢涵等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，聚磷菌在短時(shí)間內(nèi)大量增殖，聚磷菌占全菌數(shù)量比例5 d內(nèi)增加了23.59%，PHA和polyP供給不足，導(dǎo)致反應(yīng)器處理效果延后.本文的實(shí)驗(yàn)中，聚磷菌數(shù)量5 d內(nèi)平均增加了3.2%，沒有影響反應(yīng)器的處理效果.

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