路 燕 劉炯波 董 蕾 滕軍放

1)河南新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 新鄉(xiāng) 453000 2)河南淇縣人民醫(yī)院 淇縣 456750 3)鄭州大學(xué)一附屬神經(jīng)內(nèi)科 鄭州450052

近年來缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular diseases,ICVD)的病因及發(fā)病機(jī)制研究已取得很大的進(jìn)展,半胱氨酸蛋白酶抑制因子C(Cystain C)也受到越來越多研究者的關(guān)注。作者通過病例對(duì)照研究,采用多聚酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)方法,探討Cystatin C Rs2897119(-177C/T)基因與ICVD的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 185例缺血性腦血管病(ICVD組)和111例對(duì)照組來自2008-10～2009-04鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院患者及門診體檢者,均為河南漢族人。ICVD組符合1995年第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的急性缺血性腦血管病的診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)頭顱CT和(或)MRI檢查確診;對(duì)照組為無缺血性腦血管病史,無臨床血管事件發(fā)生的神經(jīng)內(nèi)科其他住院患者及健康體檢者。2組均排除腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血等出血性腦血管疾病,均無帕金森病、癡呆史,甲狀腺疾病,肝臟及腎臟疾病等及服用葉酸、維生素B12、美多芭等藥物史。ICVD組185例,男122例,女63例,年齡36～86歲。對(duì)照組111例,男71例,女40例,年齡32～87歲。各組年齡及性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.120,P＞0.05;t=1.748,P＞0.05)。

1.2 多態(tài)性檢測(cè) 采用多聚酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法。取EDTA抗凝靜脈血2 m L采用CBM公司基因提取試劑盒提取基因DNA。參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)引物,上游引物:5'-AGAGCCAGTGACTGAAGAACC-3',下游引物:5'-GATTTACAGCCAAGGAACATG-3',擴(kuò)增目的片段長度為474 bp。PCR反應(yīng)體系為30μL:PCR magic m ix 2.0酶15μL,上下游引物各2.0μL,模板DNA 2.0μL,ddH2O補(bǔ)至30μL。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性45 s,55℃復(fù)性45 s,72℃延伸55 s,循環(huán)30次;72℃延伸5 min。取3 uL PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳30 m in,EB染色檢驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果。酶切反應(yīng)體系為30 μL,包括PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL,Sma I 2.0μL,10×Buffer Tango 2.0μL,ddH2O 16μL。酶切產(chǎn)物在30℃水浴箱中溫浴5 h,經(jīng)25 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,EB染色,紫外凝膠成像儀下觀察帶型并照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以SPSS統(tǒng)計(jì)軟件16.0進(jìn)行處理。對(duì)2組基因型頻率分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。兩組年齡比較進(jìn)行t檢驗(yàn),2組性別比較進(jìn)行行列表檢驗(yàn),2組間基因型及等位基因頻率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組Cystatin C Rs2897119(-177C/T)基因型頻率和基因頻率分布 符合H ardy-W einberg平衡定律(P＞0.05),說明2組樣本有群體代表性。

2.2 Cystatin CRs2897119(-177C/T)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

片段長度為474 bp,經(jīng)Sma I酶切后,共產(chǎn)生3種基因型:純合型(T/T型)不含酶切位點(diǎn),只有474 bp;雜合型(C/T型)有474 bp、271 bp和203 bp 3個(gè)片段;純合子突變型(C/C型)有271 bp和203 bp 2個(gè)片段。增產(chǎn)物見圖1。

2.3 Cystain C Rs2897119(-177C/T)酶切產(chǎn)物 見圖2。

2.4 2組中基因型及等位基因頻率分布特征 見表1。2組中Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)基因型及等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析結(jié)果電泳圖

3 討論

缺血性腦血管疾病(ICVD)是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病之一,發(fā)病率和病死率均居神經(jīng)系統(tǒng)各類疾病首位,嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量及水平,國內(nèi)學(xué)者把缺血性腦血管疾病看作是有多種危險(xiǎn)因素相互作用的疾病。近年來有關(guān)Cystain C與ICVD關(guān)系的研究越來越受到人們的重視,相關(guān)研究層出不窮。

Cystain C又稱半胱氨酸蛋白酶抑制因子C,由有核細(xì)胞產(chǎn)生,為一種含120個(gè)氨基酸殘基多肽鏈的非糖基堿性蛋白,其基因位于20號(hào)染色體短臂上,分子量為13.395 kD,它的氨基酸序列在人類大多數(shù)組織中能夠穩(wěn)定的表達(dá),廣泛存在于各種體液中,所有有核細(xì)胞均能穩(wěn)定產(chǎn)生,Cystain C在腦脊液和精液中的濃度最高,尿液中最低。在生理?xiàng)l件下,Cystain C的重要功能是抑制內(nèi)源性的半胱氨酸蛋白酶的活性,參與細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)水解的調(diào)控,保護(hù)細(xì)胞免受不適當(dāng)?shù)膬?nèi)源性或外源性蛋白酶的水解,是目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)組織蛋白酶B抑制作用最強(qiáng)的抑制物。有報(bào)道Cystain C有抗病毒和原蟲感染的功能,可以影響中性粒細(xì)胞的遷移,可以參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,參與炎癥過程及一些神經(jīng)性疾病[1]。大部分研究認(rèn)為Cystatin C是一個(gè)具有極高的敏感性和較高的特異性的理想腎小球?yàn)V過率指標(biāo),是反應(yīng)腎功能受損的重要標(biāo)志物[2-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)Cystain C基因突變可導(dǎo)致遺傳性Cystain C淀粉樣血管病,可發(fā)生腦動(dòng)脈血管破裂,而動(dòng)物模型試驗(yàn)也證實(shí)Cystain C在血中蓄積可以導(dǎo)致腦血管淀粉樣變,考慮Cystatin C可能與腦梗死發(fā)病有關(guān)[5]。也有報(bào)道動(dòng)脈粥樣斑塊中Cystatin C含量較正常血管減少,而組織蛋白酶S及K卻過度表達(dá),認(rèn)為Cystatin C的缺失可能是動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制之一[6]。

本研究結(jié)果顯示,ICVD組中Cystain C Rs2897119(-177C/T)基因型頻率T/T、C/C、C/T分別為2.2%、81.6%、16.2%,對(duì)照組中Cystain C Rs2897119基因型頻率T/T、C/C、C/T分別為3.6%、79.3%、17.1%,2組中T、C等位基因頻率分別為10.3%、89.7%和12.2%、87.8%,兩組中Cystain C Rs2897119(-177C/T)基因型頻率及等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明Cystain C Rs2897119(-177C/T)多態(tài)性可能與ICVD不具有關(guān)聯(lián)性。本研究結(jié)果與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果一致[3],因此Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)基因多態(tài)性可能不是ICVD發(fā)生的遺傳影響因素。

鑒于所入選的樣本例數(shù)較少,收集標(biāo)本時(shí)間較短,地域局限,地區(qū)差異性不同,入選病例標(biāo)準(zhǔn)不同,有待于增加入選樣本例數(shù),延長收集病例時(shí)間,進(jìn)行多地區(qū)、多中心研究,以進(jìn)一步明確Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)多態(tài)性與ICVD的關(guān)聯(lián)。

表1 CystainCRs2897119(-177C/T)基因型頻率及等位基因頻率分布 [例(%)]

[1] 何焱,陳敬洲,王惠萍,等.半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystain C基因與中國人卒中的關(guān)系[J].中國分子心臟學(xué)雜志,2007,7(2):81-84.

[2] 楊繼紅,王雪東,吳華.Cystain C的臨床應(yīng)用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2006,7(8):430-432.

[3] 杭宏達(dá),王可平,林洪麗,等.血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C在臨床中國的應(yīng)用[J].中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)雜志,2004,2(3):214-216.

[4] 晏峰,周穎.血半胱氨酸蛋白酶抑制劑C水平對(duì)急性腦血管病患者早期腎損害的診斷價(jià)值[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,16(31):4 590-4 591.

[5] 劉存杰,王大力,彭延波.血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與腦梗死的關(guān)系[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2008,11(4),496-497.

[6] 胡欣,徐巖.半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、同型半胱氨酸與冠心病的關(guān)系[J].心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2008,17(5):461-463.