李樹(shù)娟 邵石祥 耿國(guó)鈺 蔡莉芬 盧建華 何朝霞 葉立紅

門(mén)脈高壓性胃病(portal hypertensive gastropath，PHG)是肝硬化或肝外型門(mén)靜脈高壓癥(PHT)的一種并發(fā)癥，臨床上多表現(xiàn)為慢性隱匿性出血，是肝硬化患者上消化道出血的重要原因。本文采用免疫組織化學(xué)(免疫組化)技術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮素-1(ET-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)在在PHG患中胃黏膜表達(dá)情況，觀察PHG胃黏膜的組織學(xué)表現(xiàn)，測(cè)定PHG患者的門(mén)靜脈、脾靜脈血流量，旨在探索PHG發(fā)病機(jī)制，對(duì)PHG的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取我院2006年10月至2008年12月PHT患者共60例，其中男41例，女19例;年齡22～67歲，平均年齡51．55歲;乙型、丙型肝炎肝硬化56例，酒精性肝硬化2例，原發(fā)性膽汁性肝硬化1例，隱原性肝硬化1例;肝功能按Childpugh分級(jí)，A級(jí)27例，B級(jí)32例，C級(jí)1例。PHT無(wú)PHG組:30例符合肝硬化PHT診斷標(biāo)準(zhǔn)，胃鏡下無(wú)PHG;PHG組:30例符合肝硬化PHT和PHG診斷標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組30例，男25例，女5例;年齡19～62歲，平均年齡40．85歲;對(duì)照組采用胃鏡下黏膜大致正常無(wú)肝病并符合排除標(biāo)準(zhǔn)者。所有受試者于胃鏡及B超檢查前1周停用降門(mén)脈壓藥物、NASID類(lèi)、生長(zhǎng)抑素類(lèi)藥以及影響血管活性的藥物。

1．2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):肝硬化根據(jù)2000年9月中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)會(huì)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》中肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)。PHG內(nèi)鏡診斷參考1992年新意大利內(nèi)鏡協(xié)會(huì)(new Italy endoscopy club，NIEC)分類(lèi)法。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):除外高血壓動(dòng)脈粥樣硬化、腦梗死、腦血栓、支氣管哮喘和腎衰竭等疾病，并除外曾行胃大部切除術(shù)、脾切除術(shù)、斷流術(shù)、分流術(shù)、近期大出血者及食管靜脈曲張硬化術(shù)和結(jié)扎術(shù)者。

1．3 方法

1．3．1 病理標(biāo)本的采集:行胃鏡檢查時(shí)取胃竇黏膜組織2塊，取距幽門(mén)5 cm內(nèi)的胃大彎和胃小彎胃體2塊，取于胃體上部大彎和小彎共活檢2塊。標(biāo)本要足夠大，達(dá)到黏膜肌層。中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，4%戊二醛固定，送石家莊市第五醫(yī)院病理室。

1．3．2 門(mén)靜脈血流量(portal venous flow，PVF)、脾靜脈血流量(spleen venous flow，SVF)測(cè)定:患者空腹8～12 h靜息狀態(tài)下、取仰臥位，于上午探查門(mén)靜脈、脾靜脈。探頭頻率3．5～4．0 MHz，取樣容積2～6 mm，取樣線(xiàn)與血流夾角 ＜60°。檢查時(shí)患者暫時(shí)平靜呼吸后屏氣，取3次結(jié)果的平均值，同一患者每次測(cè)定門(mén)靜脈系統(tǒng)時(shí)，取樣位置固定，取樣線(xiàn)和血流夾角保持一致。由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲科醫(yī)師操作。分別檢測(cè)門(mén)靜脈內(nèi)徑(Dpv)和血流速度(Vpv)脾靜脈內(nèi)徑(Dsv)和血流速度(Vsv)。計(jì)算靜脈血流量(Q)，計(jì)算公式Q=(D/2)2Vπ×60(Q為血流量;D為靜脈直徑;V血流速度)。

1．3．3 試劑:人抗多克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)公司)，SP試劑盒(北京中山生物技術(shù)公司)，氨丙基三乙氧基硅烷(APES)(北京中山生物技術(shù)公司)。

1．3．4 HE染色:①胃組織做4μm連續(xù)切片，經(jīng)漂片后貼附于經(jīng)充分沖洗經(jīng)APES處理過(guò)的載玻片上。撈片后置烤箱60℃，45 min，使切片緊密薪附、染色。②ET-1、VEGF、HIF-1免疫組織化學(xué)染色:石蠟包埋的胃組織以4μm的厚度連續(xù)切片，按試劑盒步驟進(jìn)行3種因子的免疫組織化學(xué)染色。③免疫組織化學(xué)染色對(duì)照設(shè)置:以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗進(jìn)行上述染色，作為空白對(duì)照，結(jié)果為陰性。棕褐色為陽(yáng)性染色。

1．3．5 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):染色后光鏡下做定性觀察。取200倍高倍視野下VEGF顯色最強(qiáng)的一個(gè)視野，通過(guò)顯微攝影系統(tǒng)攝取圖像，在圖像分析儀上應(yīng)用免疫組化計(jì)算面積軟件做定量分析代表陽(yáng)性面積率。

1．3．6 PHG積分判定標(biāo)準(zhǔn):PHG程度按改良的McMrmark’s分級(jí)分為:無(wú)，得0分;輕度為蛇皮征和(或)淡紅色斑點(diǎn)，得1分;重度為櫻桃紅斑得2分;出血得3分。PHG積分判定由3位有經(jīng)驗(yàn)的胃鏡室醫(yī)師盲法評(píng)估。

1．3．7 食道靜脈曲張判定標(biāo)準(zhǔn):按2000年3月昆明的《食管靜脈曲張內(nèi)鏡下診斷和治療規(guī)范試行方案》，將食道靜脈曲張分為輕、中、重度。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以ˉx±s表示，各組間分析用單因素隨機(jī)區(qū)組方差分析(one-way ANOVA)，計(jì)數(shù)資料相關(guān)性檢驗(yàn)采用成組設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis法)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 PHG患者的內(nèi)鏡下表現(xiàn) 內(nèi)鏡下可見(jiàn)PHG特征性的表現(xiàn)馬賽克征、紅點(diǎn)征、櫻桃紅斑。食管靜脈曲張內(nèi)鏡下可見(jiàn)食管呈蛇行迂曲或串珠狀結(jié)節(jié)狀，有的可見(jiàn)紅色征。

2．2 PHG患者胃黏膜病理表現(xiàn) 光鏡觀察黏膜毛細(xì)血管彌漫性擴(kuò)張，大多有紅細(xì)胞滲出，黏膜固有層充血水腫，炎癥不明顯。

2．3 PHG積分與食管靜脈曲張程度的相關(guān)性分析 PHG積分與食管靜脈曲張程度無(wú)相關(guān)性(HC=4．782，P ＞0．05)。

2．4 PVF、SVF測(cè)定值 PHG組PVF顯高于正常對(duì)照組(P＜0．05)。PHT無(wú)PHG組PVF與PHG組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。PHG組患者SVF顯著性高于正常對(duì)照組(P＜0．05)。PHT無(wú)PHG組SVF與PHG組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05)。見(jiàn)表1。

表1 3組PVF和SVF比較n=30，m l/min，±s

表1 3組PVF和SVF比較n=30，m l/min，±s

注:與正常對(duì)照組比較，*P ＜0．05

PVF SVF正常對(duì)照組組別674±234 221±79 PHT無(wú)PHG組 954±394* 502±486*PHG組 988±293* 533±327*

2．5 胃黏膜組織 ET-1、VEGF、HIF-1表達(dá) PHG組胃黏膜中ET-1、VEGF、HIF-1的陽(yáng)性面積顯著性高于正常對(duì)照組(P＜0．05)，PHT 無(wú)PHG 組ET-1、VEGF、HIF-1 陽(yáng)性面積表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。EF1主要表達(dá)于胃黏膜上皮細(xì)胞，胃黏膜肌層附近的血管內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞等組織細(xì)胞的胞漿中。主要表達(dá)于胃小凹頸部黏膜細(xì)漿內(nèi)，其他部位有少量陽(yáng)性著色。正常對(duì)照組胃黏膜僅見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)。PHT無(wú)PHG組陽(yáng)性面積表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。主要分布于胃黏膜病變部位腺體細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核，血管內(nèi)皮細(xì)胞也有分布。PHT無(wú)PHG組陽(yáng)性面積表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2．6 胃黏膜組織ET-1、VEGF、HIF-1表達(dá)與PHG患者內(nèi)鏡下積分的相關(guān)性分析 ET-1、VEGF、HIF-1與PHG積分呈正相關(guān)(H 分別為 10．592、10．614、9．852，P ＜0．05)。見(jiàn)表 2。

表2 3組ET-1、VEGF、HIF-1陽(yáng)性面積表達(dá)比較n=30，%，±s

表2 3組ET-1、VEGF、HIF-1陽(yáng)性面積表達(dá)比較n=30，%，±s

注:與正常對(duì)照組比較，*P ＜0．05

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2．7 HIF-1和VEGF之間的關(guān)系 HIF-1陽(yáng)性表達(dá)和VEGF的陽(yáng)性表達(dá)之呈直線(xiàn)相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)為0．842，P ＜0．01)。

3 討論

PHG是肝硬化患者上消化道出血的重要原因。內(nèi)鏡下主表現(xiàn):有猩紅熱樣黏膜表面發(fā)紅、櫻桃紅斑、紅色斑、瘀點(diǎn)、糜爛和自發(fā)性出血等。PHG出血可以表現(xiàn)為慢性隱匿性出血和貧血，也可以表現(xiàn)為致命的上消化道大出血。

3．1 PHG患者胃黏膜組織學(xué)特點(diǎn) 本研究發(fā)現(xiàn)PHG患者胃黏膜層毛細(xì)血管彌漫性擴(kuò)張，并可見(jiàn)紅細(xì)胞滲出毛細(xì)血管外，黏膜固有層充血水腫。提示在肝硬化PHT患者中胃黏膜毛細(xì)血管內(nèi)，血流受PHT的影響，血漿從增多、增寬的窗孔及缺損處漏出，導(dǎo)致胃黏膜充血、水腫、缺氧，繼而引起黏膜上皮損傷或在此基礎(chǔ)上并發(fā)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3．2 PHG與食管靜脈曲張的關(guān)系 本研究中有52．38%的PHT患者并發(fā)PHG，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并未發(fā)現(xiàn)PHG積分與食管靜脈曲張有關(guān)。目前研究均認(rèn)為PHT是PHG的啟動(dòng)因素和必要條件。PHT時(shí)門(mén)靜脈壓力高于胃靜脈，致胃靜脈血液回流受阻，胃黏膜及黏膜下毛細(xì)血管擴(kuò)張，動(dòng)靜脈短路形成與開(kāi)放，胃黏膜有效循環(huán)血流量減少［1］。本研究結(jié)果顯示，PHG組與PHT無(wú)PHG組PVF和SVF明顯高于正常對(duì)照組(P＜0．05)。說(shuō)明PHT患者存在高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)。

3．3 ET-1在胃黏膜中的表達(dá)及意義 ET-1具有收縮血管作用，作用主要是通過(guò)其特異性受體介導(dǎo)，尤其在調(diào)節(jié)血管張力和局部組織微循環(huán)中起著非常關(guān)鍵的作用。近來(lái)發(fā)現(xiàn)特異的內(nèi)皮素受體至少有兩種:ETAR和ETBR。ET-1也可通過(guò)激活ETAR而增強(qiáng)胃微血管的通透性。PHG動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，ETAR/ETBR的拮抗劑可逆轉(zhuǎn)PHG胃黏膜的高通透性。研究發(fā)現(xiàn)，PHG組患者胃黏膜中ET-1的陽(yáng)性面積顯著性高于正常對(duì)照組，主要表達(dá)于胃黏膜上皮細(xì)胞，胃黏膜肌層附近的血管內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞等組織細(xì)胞的胞漿中。ET-1與PHG積分呈顯著性正相關(guān)。因此，在PHG的ET-1過(guò)量產(chǎn)生可通過(guò)ETAR而損害胃黏膜微循環(huán)。

3．4 VEGF在胃黏膜中的表達(dá)及意義 VEGF是一種特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能因子，具有促進(jìn)微靜脈、小靜脈通透性增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、細(xì)胞質(zhì)鈣聚集以及誘導(dǎo)血管生成等作用。本研究顯示，PHG組患者胃黏膜中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)顯著性高于正常對(duì)照組。主要表達(dá)于胃小凹頸部黏膜細(xì)漿內(nèi)，其他部位有少量陽(yáng)性著色。趙永忠等［2］發(fā)現(xiàn)門(mén)靜脈高壓癥大鼠模型胃黏膜中VEGF表達(dá)明顯升高，同時(shí)胃黏膜血管VEGF高表達(dá)說(shuō)明VEGF還可以增加血管通透性，增加胃黏膜出血幾率。Brat等［3］發(fā)現(xiàn)PHT大鼠模型胃黏膜血流量降低，VEGF表達(dá)高于對(duì)照組，臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了胃黏膜VEGF的高表達(dá)在PHG發(fā)病機(jī)制中的重要意義。

3．5 HIF-1在胃黏膜中的表達(dá)及意義 胃黏膜血液循環(huán)障礙是PHT的重要病理生理變化和PHG的主要發(fā)生機(jī)制［4］。胃黏膜微循環(huán)瘀血，大量動(dòng)靜脈短路開(kāi)放，使胃黏膜組織細(xì)胞得不到充分的氧和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，胃黏膜處于缺氧狀態(tài)。Brat等［3］發(fā)現(xiàn)PHT大鼠模型胃黏膜血流量降低，低氧狀態(tài)誘導(dǎo)一系列特異性的與血管生成、缺氧代謝密切相關(guān)的基因，其中起關(guān)鍵作用的是HIF-1。這些靶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子有一個(gè)小于100 bp的DNA序列，稱(chēng)為缺氧反應(yīng)元件(HRE)［5］，介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)。其中具有一個(gè)或多個(gè)HIF-1結(jié)合位點(diǎn)(共有序列，5'A/GGGTG3')，該位點(diǎn)的突變將導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的喪失?；罨腍IF-1與靶基因上的HIF-1結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物從而啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄［6］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PHG組患者胃黏膜中HIF-1的陽(yáng)性表達(dá)顯著性高于正常對(duì)照組。主要分布于胃黏膜病變部位腺體細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核，血管內(nèi)皮細(xì)胞也有分布。參與了PHG的發(fā)生和發(fā)展，通過(guò)促進(jìn)新生血管形成，加重PHG。

3．6 HIF-l和VEGF表達(dá)的關(guān)系HFI-1是由一個(gè)120 kD的α亞單位和一個(gè)91/93/94 kD的β亞單位組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1α是惟一的氧調(diào)節(jié)亞單位，決定HIF-1的活性，在低氧條件下能誘導(dǎo)VEGF以及一些下游基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致缺血組織的新生血管形成［7］。

本研究顯示，HIF-1與VEGF表達(dá)在PHG組呈正相關(guān)，表明HIF-1通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)升高，擴(kuò)張血管促進(jìn)高動(dòng)力循環(huán)，增加管壁通透性，加重瘀血水腫，進(jìn)一步削弱胃黏膜屏障，形成惡性循環(huán)，從而使PHG加重。但從相關(guān)系數(shù)看，相關(guān)程度并不十分密切，說(shuō)明了缺氧狀態(tài)除了通過(guò)HIF-1外，還有其他途徑影響著VEGF的表達(dá)或還有其他因素通過(guò)影響VEGF的表達(dá)在PHG的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，ET-1、VEGF、HIF-I在 PHG的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程發(fā)揮著重要作用，為PHG的防治提供了重要的理論依據(jù)。

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