謝 捷，李紅娟，朱興一，楊 凡，王 平*

(浙江工業(yè)大學藥學院，制藥工程省部共建教育部重點實驗室，浙江 杭州 310014)

響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取牛蒡苷的工藝優(yōu)化

謝 捷，李紅娟，朱興一，楊 凡，王 平*

(浙江工業(yè)大學藥學院，制藥工程省部共建教育部重點實驗室，浙江 杭州 310014)

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化牛蒡苷閃式提取的工藝條件。以牛蒡苷得率為指標，在單因素試驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Benhnken中心組合設(shè)計試驗，對提取工藝影響較大的乙醇體積分數(shù)、提取時間和液料比3個工藝參數(shù)進行優(yōu)化。最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)83%、提取時間93s、液料比17:1(mL:g)、牛蒡子粒徑≤1.0mm，在此工藝條件下，牛蒡苷得率為31.62mg/g，與預(yù)測值31.72mg/g基本相符。閃式提取法是一種快速有效的提取牛蒡苷的方法。

閃式提取；牛蒡苷；響應(yīng)面分析法

牛蒡子為菊科植物牛蒡(Arctium lappa L.)的干燥成熟果實。牛蒡子性寒，味辛、苦，為常用中藥[1]。牛蒡子的化學成分較多，主要藥效成分為牛蒡苷與牛蒡苷元[2]，具有抗癌[3]、抗菌[4]及疏散風熱、解毒透疹、利咽消腫等功效[5-6]。目前，牛蒡苷的提取有乙醇加熱回流法[7-8]、超聲-微波輔助提取法[9]和水煮法[10]，但以乙醇加熱回流法應(yīng)用最廣，提取過程通常需要2h以上。閃式提取法是一種快速、有效的提取方法，能在常溫下，利用高速機械剪切力、攪拌力以及高速旋轉(zhuǎn)的刀刃之間產(chǎn)生的渦流負壓，迅速破壞植物組織細胞，使細胞內(nèi)部的化學成分(或有效成分)與溶劑充分接觸，溶解轉(zhuǎn)移，并在很短時間內(nèi)達到溶解平衡，實現(xiàn)高效提取的目的[11-12]。本研究將閃式提取器應(yīng)用于牛蒡苷的提取，采用響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，對閃式提取工藝條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛蒡子 浙江天一堂藥業(yè)有限公司；牛蒡苷對照品(純度99%) 中國藥品生物制品檢定所；乙醇(化學純)；甲醇(色譜純)。

FSH-22可調(diào)閃式提取器 鄭州金星科技有限公司；HX-200高速中藥粉碎機 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；DZF真空干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 牛蒡苷檢測方法的建立

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XTeert C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；檢測波長：230nm；流動相：甲醇-水(45:55，V/V)；流速：1mL/min；柱溫：35℃。

1.2.2 標準曲線的繪制

精確稱取牛蒡苷標準品28.4mg，用甲醇溶解，定容至100mL。分別精密吸取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分別進樣10μL。以進樣質(zhì)量濃度X為橫坐標、峰面積積分值Y為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸，得線性回歸方程為Y=1663.5X-174.79(R2=0.9982)，表明牛蒡苷質(zhì)量濃度在0.0568～0.284g/L范圍內(nèi)與峰面積具有很好的線性關(guān)系。

1.2.3 藥材中牛蒡苷含量的測定

根據(jù)《中國藥典》(2005版)牛蒡苷含量測定的方法，取本批藥材粉末(過三號篩)0.5g，精密稱定，置于50mL量瓶中，加甲醇約45mL，超聲處理(功率150W、頻率20kHz)20min，加甲醇至刻度，搖勻、濾過，得待測溶液。精密吸取待測溶液10μL，進行HPLC分析。經(jīng)標準曲線方程計算得該批藥材牛蒡苷的含量為33.5mg/g。

1.3 牛蒡苷提取工藝的優(yōu)化

1.3.1 單因素試驗

精確稱取牛蒡子10.0g(粒徑3.3～0.2mm)，加入不同體積分數(shù)的乙醇溶液，閃式提取一定的時間，過濾，取上清液，濃縮，得浸膏。以牛蒡苷得率為指標，選取乙醇體積分數(shù)、閃式提取時間、液料比和牛蒡子粒徑進行單因素試驗。

1.3.2 響應(yīng)面分析試驗

綜合單因素試驗結(jié)果，利用響應(yīng)面分析法對工藝參數(shù)進行優(yōu)化。選取對牛蒡苷得率影響較大的乙醇體積分數(shù)、提取時間和液料比3個因素。通過Design Expert 7.0軟件，根據(jù)Box-Benhnken試驗設(shè)計原理，對提取工藝進行響應(yīng)面分析，求出數(shù)學模型，得到最佳工藝參數(shù)。分析因素與水平設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.4 牛蒡苷得率的計算

將浸膏用甲醇溶解，定容至100mL，再吸取1mL于25mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，進樣10μL。根據(jù)標準曲線方程計算牛蒡苷質(zhì)量濃度，計算牛蒡苷得率。

式中：C為牛蒡苷質(zhì)量濃度/(g/L)；N為稀釋倍數(shù)；m為牛蒡子質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對牛蒡苷得率的影響

固定閃式提取時間100s、液料比15:1(mL/g)，牛蒡子粒徑≤1.0mm，考察乙醇體積分數(shù)(20%、40%、60%、80%、100%)對牛蒡苷得率的影響。由圖1可知，牛蒡苷得率隨乙醇體積分數(shù)的升高而增加，乙醇體積分數(shù)為80%時，牛蒡苷的得率最高。牛蒡苷易溶于乙醇，不溶于水，隨乙醇體積分數(shù)的提高，溶解度相應(yīng)增大，得率隨之提高。因此，中心組合試驗選取乙醇體積分數(shù)范圍為60%～100%。

圖1 乙醇體積分數(shù)對牛蒡苷得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of arctiin from Arctium lappa L.

2.1.2 提取時間對牛蒡苷得率的影響

固定乙醇體積分數(shù)80%、液料比15:1、牛蒡子粒徑≤1.0mm，考察閃式提取時間(20、60、100、140、180s)對牛蒡苷得率的影響。由圖2可知，當提取時間達到100s時，牛蒡苷得率最高，再延長提取時間，容易引起部分內(nèi)酯鍵的破壞，從而導(dǎo)致牛蒡苷得率的下降。因此，中心組合試驗選擇提取時間的范圍為60～140s。

圖2 提取時間對牛蒡苷得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of arctiin from Arctium lappa L.

2.1.3 液料比對牛蒡苷得率的影響

固定乙醇體積分數(shù)80%、閃式提取時間100s、牛蒡子粒徑≤1.0mm，考察液料比(5:1、10:1、15:1、20:1、25:1)對牛蒡苷得率的影響。由圖3可知，當液料比由從5:1增加至15:1時，牛蒡苷得率隨之增大，并達到最大值，繼續(xù)增加液料比，牛蒡苷得率幾乎不變。液料比的增加加速了溶媒的傳質(zhì)過程，有助于牛蒡苷的溶出。因此中心組合試驗選擇液料比的范圍為10:1～20:1。

圖3 液料比對牛蒡苷得率的影響Fig.3 Effect of liquid-material ratio on extraction rate of arctiin from Arctium lappa L.

2.1.4 粒徑對牛蒡苷得率的影響

將牛蒡子預(yù)粉碎后過篩，分別得到粒徑為≤3.3、1.6、1.0、0.6、0.2mm的粗粉。固定乙醇體積分數(shù)80%、閃式提取時間100s和液料比15:1，考察不同粒徑對牛蒡苷得率的影響。由圖4可知，當牛蒡子粗粉的粒徑小于1.0mm時，牛蒡苷的得率基本穩(wěn)定在31.5mg/g左右?？紤]到閃式提取過程中，高速的機械剪切作用和攪拌力能在短時間內(nèi)將植物組織充分粉碎。因此，選擇牛蒡子粒徑≤1.0mm，并在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中不再作為考察因素。

圖4 粒徑對牛蒡苷得率的影響Fig.4 Effect of particle size on extraction rate of arctiin from Arctium lappa L.

2.2 工藝條件優(yōu)化的響應(yīng)面分析試驗

Box-Benhnken試驗結(jié)果如表2所示，試驗1～12為析因試驗，13～15為中心試驗。其中：X1=(乙醇體積分數(shù)-80)/20，X2=(提取時間-100)/40，X3=(液料比-15)/5。以牛蒡苷得率(Y)為響應(yīng)值，各因素經(jīng)回歸擬合后，得二次多項回歸方程為：

Y=31.62＋0.13X1-0.21X2＋0.51X3＋0.12X1X2＋0.53X1X3-0.15X2X3-0.84X12-0.66X22-1.11X32

表2 Box-Benhnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Benhnken experiments

表3為回歸方差分析結(jié)果。該模型回歸顯著(P= 0.0001)，R2=0.9732，失擬項不顯著，說明該模型與實際試驗擬合較好，可以用于閃式提取牛蒡苷試驗的理論預(yù)測。從F值的分析結(jié)果X1(F=2.13)、X2(F=6.16)、X3(F=35.83)可以看出，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對牛蒡苷得率的影響順序為：液料比＞提取時間＞乙醇體積分數(shù)。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of regression model

圖5直觀反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。從圖5A可以看出，不同的提取時間對乙醇體積分數(shù)的響應(yīng)拋物曲線最高點位置的影響較小，不同的乙醇體積分數(shù)對提取時間響應(yīng)拋物曲線最高點位置的影響也較小，等高線幾乎呈圓形，說明乙醇體積分數(shù)和提取時間兩個因素的交互作用很小。從圖5B可以看出，不同的液料比對乙醇體積分數(shù)的響應(yīng)拋物曲線最高點位置的影響較大，不同的乙醇體積分數(shù)對液料比響應(yīng)拋物曲線最高點位置的影響也較大，等高線呈橢圓形，說明乙醇體積分數(shù)和液料比兩個因素存在的交互作用顯著。從圖5C可以看出，不同的液料比對提取時間的響應(yīng)拋物曲線最高點位置的影響較大，不同的提取時間對液料比的響應(yīng)拋物曲線最高點位置的影響較小，說明提取時間和液料比兩個因素存在一定的交互作用，但不顯著。

圖5 各兩因素交互作用對牛蒡苷得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of cross-interactions among two factors on extraction rate

2.3 提取工藝條件的確定

結(jié)合回歸模型的數(shù)學分析可知，牛蒡苷閃式提取的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)83.04%、提取時間92.93s、液料比16.38:1、牛蒡子粒徑≤1.0mm?？紤]到試驗操作的可行性，將最優(yōu)提取條件調(diào)整為乙醇體積分數(shù)83%、提取時間93s、液料比17:1、牛蒡子粒徑≤1.0mm。實驗重復(fù)3次，在此條件下牛蒡苷的理論得率為31.72mg/g，實際得率為31.62mg/g。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化所得的閃式提取工藝參數(shù)準確可靠，具有一定的實用價值。

3 結(jié) 論

將響應(yīng)面分析法應(yīng)用于牛蒡苷閃式提取工藝的研究，采用合理的試驗設(shè)計，對提取工藝進行全面分析和評測，并依據(jù)回歸分析得到牛蒡苷閃式提取的最佳工藝條件：乙醇體積分數(shù)83%，提取時間93s，液料比17:1(mL:g)，牛蒡子粒徑≤1.0mm。此時，牛蒡苷的實際得率為31.62mg/g，與理論值31.72mg/g 基本相符，說明模型預(yù)測可靠。將閃式提取法應(yīng)用于牛蒡苷的提取，能顯著縮短提取時間，且無需加熱，是一種高效的提取方法。

[1]龔又明, 劉利根, 宋科峰, 等. 牛蒡子的研究進展[J]. 海峽藥學, 2005, 17(4): 1-4.

[2]王海燕, 楊峻山. 牛蒡子化學成分的研究[J]. 藥學學報, 1993, 28 (12): 911-917.

[3]HIROSE M, YAMAGUCHI T, LIN C, et al. Effects of arctiin on PhIP-induced mammary, colon and pancreatic carcinogenesis in female Sprague-Dawley rats and MeIQx-induced hepatocarcinogenesis in male F344 rats [J]. Cancer Lett, 2000, 155(1): 79-88.

[4]RYU S Y, AHN J W, KANG Y H, et al. Antiproliferative effect of arctigenin and arctiin[J]. Arch Pharm Res, 1995, 18(6): 462-463.

[5]蔣淑敏. 牛蒡化學成分和藥理作用的研究現(xiàn)狀[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2001, 12(10): 941-942.

[6]陰鍵. 中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用: 第2分冊[M]. 北京: 中醫(yī)古籍出版社, 1995: 66.

[7]王小琳, 張玉杰, 石任兵. 正交實驗設(shè)計優(yōu)選牛蒡子的提取工藝[J].北京中醫(yī)藥大學學報, 2003, 26(4): 64-65.

[8]王勁, 史輯, 康廷國, 等. 均勻設(shè)計法優(yōu)化牛蒡子中牛蒡苷的提取工藝[J]. 中藥材, 2004, 27(2): 127-129.

[9]LOU Zaixiang, WANG Hongxin, ZHU Song, et al. Improved extraction and identi cation by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry of phenolic compounds in burdock leaves[J]. J Chromat A, 2010, 1217(16): 2441-2446.

[10]李大亮, 宋楊, 周傲華, 等. 牛蒡子水煎液及牛蒡苷、牛蒡苷元體外抗菌實驗研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥, 2004, 17(6): 433-436.

[11]劉延澤. 植物組織破碎提取法及閃式提取器的創(chuàng)制與實踐[J]. 中國天然藥物, 2007, 5(6): 401-407.

[12]吳冬梅. 閃式提取器在中藥研究中的應(yīng)用[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2006, 12(7): 34; 37.

Optimization of Homogenate Extraction for Arctiin from Arctium lappa L. by Response Surface Methodology

XIE Jie，LI Hong-juan，ZHU Xing-yi，YANG Fan，WANG Ping*
(Key Laboratory of Pharmaceutical Engineering of Ministry of Education, College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Response surface analysis (RSA) methodology was used for optimizing homogenate extraction processing of arctiin from Arctium lappa L. Based on single-factor experiments, the effects of ethanol concentration, extraction time and liquid-material ratio on extraction rate of arctiin were explored by Box-Benhnken central composite design method. The optimal extraction conditions were ethanol concentration of 83%, extraction time of 93 s, liquid-material ratio of 17:1 (mL/g) and particle size of less than 1.0 mm. Under these optimal extraction conditions, the actual yield of total arctiin was 31.62 mg/g, which was consistent with the predicted yield of 31.72 mg/g. Results indicated that homogenate extraction was an effective method to extract arctiin from Arctium lappa L.

homogenate extraction；arctiin；response surface analysis (RSA)

TS201.1

A

1002-6630(2010)24-0033-04

2010-02-05

浙江省國際合作項目(2007C14004)

謝捷(1978—)，女，講師，碩士，主要從事天然藥物化學研究。E-mail：xiejie97@sohu.com

*通信作者：王平(1969—)，女，教授，博士，主要從事天然藥物化學研究。E-mail：pharmlab@zjut.edu.cn