丁進鋒，蘇秀榕*，張春丹，李妍妍，徐嘉杰

(寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211)

海蜇膠原蛋白提取工藝及促愈合作用研究

丁進鋒，蘇秀榕*，張春丹，李妍妍，徐嘉杰

(寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211)

通過響應面法優(yōu)化海蜇膠原蛋白的提取工藝，并通過小鼠皮膚創(chuàng)傷模型研究海蜇膠原蛋白的促愈合作用。通過單因素試驗選取因素與水平，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素基礎(chǔ)上采用三因素三水平響應面分析法(RSM)，對海蜇膠原蛋白的酸法提取工藝進行優(yōu)化；采用小鼠皮膚創(chuàng)傷模型，創(chuàng)面外用膠原蛋白，并以云南白藥處理為陽性對照，通過十字測量法測量創(chuàng)面大小并計算創(chuàng)面愈合率。結(jié)果顯示海蜇膠原蛋白的最佳提取工藝條件為提取時間62.64h、液料比23.6:1，醋酸濃度0.562mol/L；動物實驗表明海蜇膠原蛋白能夠明顯縮短傷口愈合時間，對創(chuàng)面修復有促進作用。響應面法優(yōu)化得到的提取條件準確可靠；海蜇膠原蛋白具有明顯的促愈合作用。

海蜇；膠原蛋白；響應面；傷口愈合

海蜇(Rhopilema esculentum Kiahinouye)隸屬于腔腸動物門(Coelentera)、缽水母綱(Scyphozoa)、根口水母(Rhizostomeae)、根口水母科(Rhizostomatidae)、海蜇屬(Rhopilema)的無緣膜動物。世界已記錄的海蜇屬只有海蜇(R.esculentum)、黃斑海蜇(R.hispidum)、棒狀海蜇 (R. rhopalophorum)和疣突海蜇(R.verrilli)等4種。前3種在我國已有記錄。棒狀海蜇個體小(40～100mm)，傘部的中膠層薄，數(shù)量稀少，沒有捕撈價值。作為漁業(yè)生產(chǎn)的只有海蜇和黃斑海蜇兩種[1]。

海蜇經(jīng)加工后，傘部稱為海蜇皮，口腕部稱為海蜇頭，二者均具有很高的經(jīng)濟和營養(yǎng)價值，富含較高的蛋白質(zhì)及鈣、磷、碘、鐵等無機鹽和維生素等營養(yǎng)成分[2]，去水分蛋白質(zhì)占總干質(zhì)量的50%左右，其脂肪含量低[3]，是一種高蛋白低脂肪的食品。海蜇不僅是宴席佳肴，也是一味治病良藥。海蜇性咸、平，入肝腎，可消熱解毒、軟堅散結(jié)、降壓消腫等功效，并對氣管炎、哮喘、高血壓、口噪咽干、陰虛便秘等有一定的治療作用[2-5]。海蜇富含一些具有生物活性的物質(zhì)，如膠原蛋白、毒素、糖胺聚糖、糖蛋白等[5-8]，其中膠原蛋白的含量最為豐富[9]。膠原蛋白由3條α多肽鏈構(gòu)成三股螺旋結(jié)構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，分子質(zhì)量在30kD以上，不利于人體直接吸收。國內(nèi)外研究表明，水解膠原蛋白的主要產(chǎn)物膠原多肽，具有保護胃黏膜、抗?jié)?、抑制血壓上升，促進骨形成、皮膚膠原代謝等營養(yǎng)及生理功能，在食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有巨大的開發(fā)前景[10-11]。

傷口愈合是機體所具有的一種修復功能，它包括炎癥、增生期、傷口收縮、膠原代謝和上皮形成等一系列復雜過程[12]。膠原具有很強的生物活性及生物功能，能參與細胞的遷移、分化和增殖，使骨、腱、軟骨和皮膚具有一定的機械強度。因膠原的抗原性和良好的生物相容性，在燒傷、創(chuàng)傷、眼角膜疾病、美容、矯形、硬組織修復、創(chuàng)面止血等醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域用途廣泛[13]。長期以來，人們都是使用豬、牛的皮和骨提取膠原蛋白和明膠。但因瘋牛病、口蹄疫等疾病的爆發(fā)對牲畜膠原制品安全性產(chǎn)生疑慮。另外，由于宗教和習俗等原因，有些地區(qū)也不能使用牲畜膠原蛋白制品。因此，獲得膠原蛋白的新來源顯得十分迫切[14]。本實驗利用響應面設(shè)計酸法提取海蜇膠原蛋白工藝，并研究海蜇膠原蛋白的促傷口愈合作用，旨在為海蜇生物活性物質(zhì)的進一步研究提供實驗依據(jù)，并為其在功能食品、醫(yī)藥、化妝品等方面的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海蜇購于浙江省岱山縣；ICR小鼠 浙江省實驗動物中心。

L-羥脯氨酸 Sigma公司；氯胺T、鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸、高氯酸、無水乙醇、乙二醇獨甲醚、對二甲基氨基苯甲醛、濃硫酸、醋酸等均為AR 寧波奧博科學儀器有限公司；云南白藥 云南白藥集團股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新悅可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；DKS-26電熱恒溫水浴鍋 寧波江南儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白提取

1.3.1.1 單因素試驗

選取提取時間、料液比及醋酸濃度三個因素，探討其對海蜇膠原蛋白提取效果的影響。取一定量搗碎均勻的海蜇，加入適量的醋酸，在4℃條件下浸提一定時間后，10000r/min、4℃離心30min，取上清液，加入6mol/L鹽酸后130℃水解6h，測定羥脯氨酸含量[15]。

提取率/%=m/M×100

式中：m為提取的膠原質(zhì)量/mg；M為海蜇質(zhì)量/mg。

1.3.1.2 響應面優(yōu)化提取條件

根據(jù)單因素試驗確定各因素最佳條件后，以Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理設(shè)計試驗，設(shè)計3因素3水平試驗優(yōu)化海蜇膠原蛋白提取條件。

1.3.2 促愈合作用

1.3.2.1 動物分組及傷口模型建立

ICR小鼠45只，平均質(zhì)量為(20±2)g。將小鼠隨機分為3組，每組15只，分別為正常對照組(NG)、海蜇膠原蛋白組(JG)及云南白藥組(YG)。小鼠以戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，背部去毛，消毒。在小鼠背部剪去直徑約1cm的全層皮膚，造成全皮層缺損動物模型。JG組每天涂抹0.2mL 1mg/mL海蜇膠原蛋白溶液，YG組每天涂抹0.2mL 0.6mg/mL云南白藥懸浮液。以上各組均用無菌紗布包扎好，每日換藥1次，連續(xù)14d。每天對創(chuàng)傷口面觀察，測量傷口大小，并記錄結(jié)果。

1.3.2.2 傷口愈合率

每天用游標卡尺測量創(chuàng)面大小(十字測量法)，創(chuàng)傷口面積按橢圓面積計算[16]，并計算傷口愈合率。

S=0.25abπ

式中：a為傷口長軸長度；b為傷口短軸長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白提取單因素試驗

2.1.1 提取時間對膠原蛋白提取率的影響

圖1 提取時間對海蜇膠原蛋白的影響Fig.1 Effect of extraction time on the yield of jellyfish collagen

取一定質(zhì)量的海蜇，加入0.5mol/L醋酸，液料比為10:1(V/m)，在4℃條件分別浸提12、24、48、72、84h。在48h內(nèi)，隨著浸提時間的延長，膠原蛋白提取率也隨之增加，但超過48h后，提取率不再增加，因此提取時間以48h為佳(圖1)。

2.1.2 醋酸濃度對膠原蛋白提取率的影響

取一定質(zhì)量的海蜇，分別加入0.1、0.2、0.5、0.7、1.0mol/L醋酸，液料比為10:1，在4℃條件浸提48h。從圖5可看出，隨著醋酸濃度的增加，膠原蛋白提取率也增加，在0.5mol/L達到最大，超過0.5mol/L時，提取率無太大影響，因此以0.5mol/L為醋酸最佳濃度。

圖2 不同醋酸濃度對海蜇膠原蛋白提取的影響Fig.2 Effect of acetic acid concentration on the yield of jellyfish collagen

2.1.3 液料比對膠原蛋白提取率的影響

取一定質(zhì)量的海蜇，加入0.5mol/L醋酸，在4℃條件浸提48h，液料比分別為5、10、15、20、25。由圖6可看出，液料比較小時，海蜇不能完全浸于其中，提取率低，液料比大時，對膠原蛋白提取率的影響較小，并會造成膠原蛋白分離純化困難，因此提取海蜇膠原蛋白的最佳液料比為20:1。

圖3 液料比對海蜇膠原蛋白提取的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the yield of jellyfish collagen

2.2 響應面法優(yōu)化海蜇膠原蛋白的提取工藝

2.2.1 分析因素選取

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用響應面試驗設(shè)計，選取提取時間(A)、液料比(B)、醋酸濃度(C)，以海蜇膠原蛋白提取率為響應值(Y)做3因素3水平響應面試驗設(shè)計，因素及水平設(shè)計見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 響應面法分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface method

表2 響應面分析結(jié)果Table 2 The results of response surface analysis

由表3方差分析表可知，方程一次項的影響是顯著的，提取時間和醋酸濃度二次項的影響也是顯著的，交互項作用影響不顯著，說明各因素對海蜇膠原蛋白提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。為明確各因素對響應值的影響，經(jīng)回歸擬合后，試驗因素對響應值的影響可用回歸方程表示為：Y=0.988＋0.025A＋0.0125B＋0.0125C＋0.0025AB＋0.0125AC＋0.0025BC-0.02525A2-0.01025B2-0.03525 C2

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

從表3結(jié)果可看出，整體模型的P≤0.01，表明該回歸方差模型極顯著，并且失擬項不顯著，說明該模型的擬合度較好。

2.2.2 響應面分析及等高線圖

從圖4可以看出，圖4兩因素提取時間和液料比交互作用不顯著，當提取時間、醋酸濃度一定時，提取率隨液料比的增加而增加。從圖5、6可以看出，等高線呈橢圓形，說明圖中兩因素交互作用明顯。圖5和圖6表明，當醋酸濃度一定時，提取率分別隨提取時間的延長和液料比的增加而增加，到一定程度后均又有所下降。

圖4 提取時間(A)與液料比(B)對海蜇膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Response surface plots showing the effects of extraction time and substrate concentration on the yield of jellyfish collagen

圖5 提取時間(A)與醋酸濃度(C)對海蜇膠原蛋白提取率的影響Fig.5 Response surface plots showing the effects of extraction time and acetic acid concentration on the yield of jellyfish collagen

圖6 液料比(B)與醋酸濃度(C)對海蜇膠原蛋白提取率的影響Fig.6 Response surface plots showing the effects of substrate concentration and acetic acid concentration on the yield of jellyfish collagen

2.2.3 提取工藝的確定

結(jié)合回歸模型的數(shù)學分析可知，海蜇膠原蛋白的提取最佳工藝為：提取時間62.64h、液料比23.6:1、醋酸濃度0.562mol/L，在此條件下海蜇膠原蛋白的預測提取率1.002%。為了驗證實驗的可靠性，采用最佳提取條件海蜇膠原蛋白，考慮到實驗操作的可靠性，將最優(yōu)提取條件修正為提取時間63h、液料比24:1、醋酸濃度0.56mol/L，在此條件下測定的膠原蛋白的提取率為1.011%，與理論預測值的誤差為0.90%，說明采用RSM法優(yōu)化得到的浸提條件可靠。

2.3 促愈合實驗

2.3.1 肉眼觀察

小鼠術(shù)后1d，各組創(chuàng)面均有濕潤，無明顯膿液形成，無明顯感染，創(chuàng)傷面也未出現(xiàn)明顯縮小，傷口邊緣的基底細胞開始增生，覆蓋于肉芽組織的表面。

術(shù)后3d，各組創(chuàng)面均無感染，均出現(xiàn)了不規(guī)則的隆起團狀硬塊，即增生的肉芽組織，傷口收縮不明顯。

術(shù)后5d，JG組和YG組傷口有明顯的收縮，JG和YG組傷口均被填平，團塊狀隆起，創(chuàng)面完全封閉，而NG組傷口未完全封閉。

術(shù)后7d，JG組痂皮已經(jīng)脫落，邊緣新皮組織向中心發(fā)展，其他各組還未出現(xiàn)痂皮脫落現(xiàn)象，但用藥組肉芽組織體積縮小。

術(shù)后10d， JG和YG組痂皮都已自然脫落，傷口大小有明顯的變化，瘢痕觸之較為柔軟，彈性好，活動度較大，而NG組痂皮還有部分未脫落，瘢痕觸之較為僵硬，彈性差，活動度小。

2.3.2 各因素處理對創(chuàng)面愈合率的影響

由圖7可以看出，術(shù)后3d，各因素處理對創(chuàng)面愈合率比NG組有所提高，但是無顯著性差異(P＞0.05)；術(shù)后5d，JG組和YG組與N組比較，創(chuàng)面愈合率有明顯提高(P＜0.05)，術(shù)后7d，JG組和YG組與N組相比，愈合率有明顯提高(P＜0.01)；而JG組和YG組愈合率提高極顯著(P＜0.01)；術(shù)后10d，JG組和YG組愈合率較N組有極顯著差異(P＜0.01)。

圖7 各因素處理后小鼠傷口愈合率Fig.7 The healing rate of three wound treatments

3 討 論

本研究采用響應面法提取海蜇膠原蛋白，結(jié)果表明膠原蛋白最佳提取條件為：提取時間62.64h、液料比23.6:1、醋酸濃度0.562mol/L，在此條件下海蜇膠原蛋白預測得率為1.002%，實際測定值與理論預測值的誤差為0.90%。響應面分析法是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，它以回歸方程作為函數(shù)估算的工具，確定各因素及其交互作用對各指標的影響，精確地表達因素和響應值之間的關(guān)系[17]。因此本研究利用響應面法提取海蜇中的膠原蛋白，結(jié)果表明響應面法優(yōu)化得到的提取條件準確可靠，具有實用價值。

此外本研究還對所提取的膠原蛋白對小鼠傷口模型的促愈合作用進行研究，結(jié)果表明膠原蛋白溶液對創(chuàng)面模型傷口愈合有明顯的促進作用。本研究采用云南白藥作為陽性對照組，云南白藥可明顯促進小鼠堿性成纖維細胞因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的生成，bFGF與VEGF可促進成纖維細胞與血管內(nèi)皮細胞生成，因此可以加速血管的生長及結(jié)締組織增生，達到促進傷口愈合的作用。從結(jié)果可以看出膠原蛋白組對小鼠傷口的愈合率與云南白藥組相比沒有顯著差異，結(jié)果顯示膠原蛋白組和云南白藥組比正常組傷口要提前2～3d愈合。膠原蛋白是哺乳動物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣的蛋白質(zhì)，是細胞外基質(zhì)的主要成分，能誘導上皮細胞等增殖、分化和移行，且膠原纖維具有彈性，能減少創(chuàng)面的收縮?？梢源龠M成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞的分化并形成基質(zhì)。同時膠原蛋白可以促進肉芽組織生長，并為機體修復細胞提供所必需的氨基酸，加速創(chuàng)面的愈合[18]。張紅等[18]曾研究膠原蛋白對大鼠創(chuàng)傷皮膚的促愈合作用，結(jié)果表明膠原蛋白能加速大鼠創(chuàng)傷模型的愈合率，有效促進大鼠創(chuàng)傷皮膚的愈合。

仇樹林等[19]研究表明羥脯氨酸含量的增加，能加速創(chuàng)面的愈合，同時也提高創(chuàng)面的愈合質(zhì)量。而羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分，并是一種具有獨特生理活性的氨基酸，它可以作為化妝品添加劑，具有抗氧化、抗輻射的作用；可作為各種軟組織疾病的藥物，如結(jié)締組織受損、風濕性關(guān)節(jié)炎等，又可加快傷口愈合，以及治療各種皮膚疾病等生物活性[20]。

筆者認為膠原蛋白組涂抹了膠原蛋白，增加了羥脯氨酸的含量，從而促進了創(chuàng)面膠原纖維的合成，這可能是膠原蛋白促進傷口愈合的一重要機制；此外膠原蛋白是皮膚細胞外基質(zhì)的主要成分，細胞外基質(zhì)加速重建，可為表皮細胞等增殖、分化和移行提供一個合適的微環(huán)境，因此這也可能是膠原蛋白促進傷口愈合的一重要環(huán)節(jié)。但海蜇膠原蛋白的促進傷口愈合詳細機理還有待進一步研究。

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Extraction of Collagen from Jellyfish (Rhopilema esculentum) and Wound Healing-Promoting Effect in Mouse

DING Jin-feng，SU Xiu-rong*，ZHANG Chun-dan，LI Yan-yan，XU Jia-jie
(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The optimum condition of jellyfish (Rhopilema esculentum Kiahinouye 1891) collagen was studied, and the effect of jellyfish collagen on promoting the wound healing was studied based on the model of mouse skin wounds. Experimental factors and their levels were determined by single-factor tests, and then a three factors and three levels test was designed based on the principle of Box-Benhnken design. The extraction conditions were optimized through response surface method (RSM). In the experiment of wound healing in mouse, cutting-skin injures model in mouse were created and wounds were treated with collagen, at the same time yunnan baiyao was used as positive control. The size of wounds was measured through cross measurement, and the healing rates were calculated. Results showed the optimal conditions of jellyfish collagen extraction were obtained as following: extraction time 62.64 h, the solid/water ratio of 1:23.6, acetic acid concentration of 0.562 mol/L. Animal tests showed that treatment with collagen could significantly accelerate the process of re-epithelialization, and promote wound healing.

jellyfish；collagen；Response surface method (RSM)；wound healing

TS254.4

A

1002-6630(2010)24-0019-05

2010-08-13

浙江省自然科學基金項目(Y304358)；寧波市科技局重點資助項目(200120041)

丁進鋒(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：djfeng_0617@163.com

*通信作者：蘇秀榕(1956—)，女，教授，博士，研究方向為食品科學與工程、生物化學與分子生物學。E-mail：suxiurong@nbu.edu.cn