周葉萍綜述,舒茂琴審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院心血管內(nèi)科/重慶市介入心臟病學(xué)研究所,重慶400038)

Geminin在細(xì)胞周期中的作用研究進(jìn)展

周葉萍綜述,舒茂琴審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院心血管內(nèi)科/重慶市介入心臟病學(xué)研究所,重慶400038)

Geminin;細(xì)胞分裂周期蛋白-10依賴性轉(zhuǎn)錄因子;細(xì)胞周期;再復(fù)制

隨著生物學(xué)的飛速發(fā)展,關(guān)于細(xì)胞周期調(diào)控的研究越來越受到人們的關(guān)注。對細(xì)胞周期相關(guān)因子 Geminin(起始特許阻遏子)的研究已成為熱點(diǎn)。Geminin是一種定位于核內(nèi)的小分子蛋白,具有相對復(fù)雜的結(jié)構(gòu)模式,預(yù)示著它的功能多樣性。它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期時相中的重要事件作用于細(xì)胞增殖;經(jīng)多種途徑參與DNA復(fù)制的調(diào)節(jié);抑制中心體重復(fù)復(fù)制[1];推進(jìn)G2/M期和維持正常胞質(zhì)分裂等;調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育,尤其是神經(jīng)的發(fā)生,還可以與同源異型盒蛋白或是基因相互作用,在細(xì)胞增殖與分化中發(fā)揮協(xié)調(diào)的功能,近年研究還發(fā)現(xiàn)它可能具有癌基因功能,而且隨著研究的深入和對 Geminin功能的更多的發(fā)掘,該蛋白的功能將被進(jìn)一步地闡明。現(xiàn)對 Geminin蛋白結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控機(jī)制及其在細(xì)胞周期中作用的研究進(jìn)展做一綜述。

1 Geminin的結(jié)構(gòu)及定位

Geminin是一種多細(xì)胞生物蛋白,相對分子質(zhì)量為25 klD,由 Geminin基因編碼,存在于細(xì)胞核內(nèi)[2],但不存在于酵母中[3]。有研究于1998年在非洲蟾蜍卵的有絲分裂期中,從cDNA編碼的蛋白選擇性地降解提取物中發(fā)現(xiàn)了 Geminin,它有2種異構(gòu)體——GemininH和 GemininL,分別含有 219和216個氨基酸。通過檢測 Geminin氨基酸序列已經(jīng)鑒定出了幾個結(jié)構(gòu)基序[4]。

分辨率為17.5A的電子顯微鏡揭示了人類 Geminin蛋白三維圖[5]:頭代表 Geminin的N末端,中心體對應(yīng)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域,頸代表阻止DNA再復(fù)制區(qū)域。N末端為泛素化的位點(diǎn)。Geminin中心部位氨基酸序列能夠形成一種可變的卷曲螺旋(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域,該種結(jié)構(gòu)域通常與蛋白質(zhì)二聚體相關(guān)[6],能與細(xì)胞分裂周期蛋白-10依賴性轉(zhuǎn)錄因子(cdcl0 dependent transcriptl,CDT1)牢固結(jié)合[7]。晶體學(xué)揭示了 Geminin 3個可能與CDT1結(jié)合的區(qū)域[8]:(1)暴露的帶負(fù)電荷的谷氨酸根對于與CDT1靜電相互作用是必需的;(2)N末端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域增加了10個可以結(jié)合到中心區(qū)域的上游基團(tuán);(3)N末端可變的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域可以和CDT1N末端100個氨基酸相結(jié)合。

2 Geminin與細(xì)胞周期

細(xì)胞周期劃分為 G1期和S期,G2期和M期4個時相,進(jìn)入增殖周期的細(xì)胞只有在各個時相中準(zhǔn)確地完成相應(yīng)事件,才能確保增殖周期的順利進(jìn)行。在 G1期早期,細(xì)胞分裂周期蛋白-6(cell division cycle-6,CDC6)的表達(dá)水平一過性升高,與起始識別復(fù)合物((origin recognition complex,ORC)結(jié)合在一起,之后微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance,MCM)形成環(huán)狀復(fù)合物,位于細(xì)胞核中的 CDC6協(xié)同促進(jìn)MCM環(huán)狀復(fù)合物加載于染色質(zhì)上,使其結(jié)合到復(fù)制原點(diǎn)鄰近的DNA上,這樣完整的具有活性的前復(fù)制復(fù)合物(Pre-RC)裝備完成,DNA開始復(fù)制[9]。

研究證明,Geminin在細(xì)胞周期的各時期中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用,其作用方式也不一樣。它是 G1期向S期轉(zhuǎn)化的起始信號,在S期開始增加,在M期達(dá)高峰,在下一個 G1期到來前降解[10]。在M期:分裂后期促進(jìn)復(fù)合物(APC)活性增強(qiáng),誘導(dǎo) Geminin基因的“破壞盒”發(fā)生突變,水解 Geminin蛋白。Geminin從M期降解后,促使DNA復(fù)制的啟動,因此,Geminin對DNA復(fù)制啟動是非常重要的,直到細(xì)胞分裂完成;S期:它能連接CDT1并使之失活,確保DNA在復(fù)制完后不發(fā)生再復(fù)制;Geminin通過與CDT1結(jié)合使之失活,從而阻止Pre-RC的完整性及穩(wěn)定性,妨礙MCM加載到染色體上,造成DNA復(fù)制啟動的停止。在S期起始階段,Geminin開始在核內(nèi)聚集。Geminin二聚體而不是單體在胞漿內(nèi)與游離的CDT1緊密結(jié)合,從而阻止S期Pre-RC的形成[9],而且 Geminin的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域C端通過位阻阻斷了MCM家族裝載到CDT1的通路[11-12]。核內(nèi) Geminin蛋白從S期到 G1期一直維持到有絲分裂期末[13],然后,經(jīng)過一系列不同的可能系種族特異性途徑來滅活,而這種滅活機(jī)制對于游離CDT1的存在及準(zhǔn)許下一輪DNA復(fù)制是必需的。

腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的增殖遵循同樣的細(xì)胞周期,但是調(diào)控機(jī)制不同。關(guān)于導(dǎo)致癌癥最常見的說法是 G1、S或 G2期檢查點(diǎn)的功能障礙。Geminin保證了適當(dāng)?shù)膹?fù)制及通過S期,因此它被推斷為一種腫瘤抑制物,而不是致癌基因,然而表達(dá)分析卻顯示在腫瘤組織或變異細(xì)胞中 Geminin表達(dá)上升[14]。在散在的非浸潤性乳腺癌中,Geminin水平與腫瘤分期有關(guān)[15]。在乳腺癌早期,Geminin表達(dá)就已經(jīng)升高,而且過表達(dá)預(yù)示著腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良[14]。在直腸癌,Geminin水平隨著放化療的進(jìn)行而下降,最近已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)研究把 Geminin作為腫瘤轉(zhuǎn)移及腫瘤發(fā)生的分子標(biāo)記。

3 G eminin與CDT1之間的平衡

細(xì)胞周期里的相關(guān)蛋白水平的定量變異要求精密的調(diào)控機(jī)制,這些機(jī)制的闡明將有助于進(jìn)一步了解在腫瘤發(fā)生中Geminin與CDT1的作用原理。Saxena和Dutta[16]用體DNA復(fù)制分析方法證實(shí)了 Geminin作用的靶體是CDT1:(1)Geminin與CDT1結(jié)合;(2)CDT1的降解和 Geminin過度表達(dá)都能有效阻止復(fù)制進(jìn)行;(3)CDT1的過度表達(dá)可以使被 Geminin阻止的復(fù)制再次進(jìn)行。這表明 Geminin通過CDT1發(fā)揮抑制細(xì)胞周期的作用。兩者結(jié)合后使CDT1失活,從而阻止 Pre-RC結(jié)構(gòu)的完整性及功能的穩(wěn)定性,妨礙MCM加載到染色體上,造成MCM復(fù)制啟動的停止。由此可見這對矛盾體間的平衡對基因穩(wěn)定起著重大的作用[17]。在體細(xì)胞的細(xì)胞周期里,Geminin與CDT1蛋白水平是可以互補(bǔ)的[13,18]。一項(xiàng)最新研究證明 Geminin-CDT1復(fù)合體在復(fù)制起點(diǎn)作為分子開關(guān),能夠阻止DNA復(fù)制的啟始,并能將MCM解鏈酶加載到染色質(zhì)上[19]。因此,Geminin只有在進(jìn)入 S期之前再活化,且與CDT1兩者之間達(dá)到一種恰當(dāng)?shù)谋壤龝r它才能抑制CDT1的活性[18]。有研究顯示在DNA復(fù)制準(zhǔn)許期間,先被征募到染色體的 Geminin與CDT1形成復(fù)合物裝訂到染色體,與MCM2-7復(fù)合物相互作用,準(zhǔn)許染色體在每一細(xì)胞周期復(fù)制1次。另一方面征募額外的 Geminin抑制CDT1-Geminin復(fù)合物的活性預(yù)防再復(fù)制發(fā)生。在人類細(xì)胞Geminin在G2-M期允許CDT1聚集起積極作用;在S-G2期阻止DNA復(fù)制準(zhǔn)許的啟動。因此,在快速分裂細(xì)胞和癌細(xì)胞中也有 Geminin高水平的表達(dá)[20]。更為重要的是,Geminin翻譯后調(diào)控[21]可能對于它能夠在不同的狀態(tài)間迅速轉(zhuǎn)化是極其關(guān)鍵的[19]。

4 Geminin蛋白水平的試驗(yàn)性調(diào)節(jié)

被高度控制了的細(xì)胞周期調(diào)控因子水平的平衡,能夠被獲得或失去功能途徑而試驗(yàn)性地擾亂。向果蠅體內(nèi)注射 Geminin的非降解形式-mRNA或是通過 Ga14/UAS系統(tǒng)錯誤表達(dá)Geminin,都能有效地阻礙 Pre-RC的裝配[13,22],然后MCM蛋白的裝載被抑制,而染色質(zhì)與ORC的結(jié)合卻未受影響[13]。這種復(fù)制的阻斷作用可以通過過量的CDT1表達(dá)而得以有效地復(fù)蘇[9,22]。野生型的 Geminin瞬間過表達(dá)不能產(chǎn)生主要效應(yīng),也不能阻止細(xì)胞周期進(jìn)行[9]。然而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后卻可以觀察到在S期增殖和聚集起來的細(xì)胞熒光放射增強(qiáng)。在培養(yǎng)細(xì)胞中,隨著 Geminin的穩(wěn)定表達(dá),可以觀察到更多的變化。這種效應(yīng)有賴于內(nèi)皮 Rb蛋白的存在[22]。HCT116(結(jié)腸癌細(xì)胞)(Rb+)可以表達(dá)與生理水平相似的穩(wěn)定形式的 Geminin,因此可以阻止增殖并啟動DNA損傷檢查點(diǎn)途徑,但是無凋亡[22]。在過度表達(dá)試驗(yàn)中,這種表型能夠通過相應(yīng)升高的CDT1所復(fù)蘇。在裸鼠體內(nèi),移植包含非降解 Geminin可以產(chǎn)生較少的腫瘤形式[14]。單獨(dú)過表達(dá)CDT1能夠產(chǎn)生重復(fù)復(fù)制,基因不穩(wěn)定性及惡性轉(zhuǎn)移[15]。通過反義技術(shù)試驗(yàn)性下調(diào) Geminin水平,如顯性負(fù)相途徑、免疫耗竭、RNAi、siRNA或遺傳突變用于促進(jìn)細(xì)胞分裂[22-23]。Hela細(xì)胞在耗竭 Geminin后不會出現(xiàn)染色體破損、斷裂或死亡,也沒有重復(fù)制發(fā)生,可能與CDT1在S期被有效地遍在蛋白化及蛋白水解作用有關(guān)[24]。由此可見,似乎 Geminin僅僅是在細(xì)胞被剝脫了其他調(diào)控機(jī)制的情況下對于控制正常的細(xì)胞周期進(jìn)程是非常必要的。

5 展 望

嚴(yán)格的DNA復(fù)制對于保證細(xì)胞周期中染色體的適當(dāng)?shù)膹?fù)制與分離是必需的。細(xì)胞周期調(diào)控異?？蓪?dǎo)致基因不穩(wěn)定性及細(xì)胞惡性增殖。Geminin作為參與細(xì)胞增殖周期調(diào)控的重要細(xì)胞周期相關(guān)因子,對它的生物學(xué)特性正進(jìn)一步深入地認(rèn)識。越來越多的報道指出,Geminin具有連接細(xì)胞增殖和胚胎分化的功能,但關(guān)于 Geminin這種“仲裁者”作用的詳細(xì)信息尚不明確。如Geminin與同源異型盒蛋白到底是怎樣作用的?同源異型盒蛋白與CDT1競爭的重要性在哪里?Geminin在神經(jīng)發(fā)生的不同階段和不同空間內(nèi)的作用是怎樣定位的?作用時間如何選擇?Geminin與腫瘤的關(guān)系?這些問題有待更多的實(shí)驗(yàn)探索去解答[25]。

[1]Lu F,Lan R,Zhang H,et al.,Geminin is partially localized to the centrosome and plays a role in proper centrosome duplication[J].Biol Cell,2009,101:273.

[2]文川,萬伍卿.細(xì)胞周期相關(guān)因子 Geminin及其臨床意義[J].醫(yī)學(xué)臨床研究,2006,4(23):616.

[3]Andrew CG Porter.Preventing DNA over-replication:a Cdk perspective[J].Cell Division,2008,3:3.

[4]Pitulescu M,Kessel M,Luo L.The regulation of embryonic patterning and DNA replication by Geminin[J].Cell Mol Life Sci,2005,62(13):1426.

[5]Okorokov AL,Orlova EV,Kingsbury SR,et al.Molecular structure of human Geminin[J].Nat Struct Mol Biol,2004,11:1021.

[6]Pitulscu M,Kessel M,Luo L.The regulation of embryonic pattening and DNA replication by Geminin[J].Cell Mol Life Sci,2005,62(13):1425.

[7]Seo SL,Kroll KL.Geminin′s Double Life Chromatin Connections that Regulate Transcription at the Transition from Proliferation to Differentiation[J].Cell Cycle,2006,5:4,378

[8]Okorokov AL,Orlova EV,Kingsbury SR,et al.Molecular structure of human Geminin[J].Nat Struct Mol Biol,2004,11:1021.

[9]Valentina S,Silvia F,Roberta F,et al.HOXD13 Binds DNA Replication Origins To Promote Origin Licensing and Is Inhibited by Geminin[J].Mol Cell Biol,2009:5775

[10]Lygerou L,Nurse P.Cell cycle:License wit hheld2Geminin Blocks DNA Replication[J].Science,2000,290:2271.

[11]Lee C,Hong B,Choi JM,et al.Structural basis for inhibition of the replication licensing factor CDT1 by Geminin[J].Nature,2004,430:913.

[12]Cook J G,Chasse DA,Nevins JR.The regulated association of CDT1 withminichromosome maintenance proteins and Cdc6 in mammalian cells[J].J Biol Chem,2004,279:9625.

[13]Xouri G,Dimaki M,Bastiaens PI,et al.CDT1 Interactions in the licensing process a model for dynamic spatiotemporal control of licensing[J].Cell Cycle,2007,6:1549.

[14]Montanari M,Boninsegna A,Faraglia B,et al.Increased expression of Geminin stimulates the growth of mammary epithelial cells and is a frequent event in human tumors[J].J Cell Physiol,2005,202:215.

[15]Vaziri C,Saxena S,Jeon Y,et al.A p53-dependent checkpoint pathway prevents rereplication[J].Mol Cell,2003,11:997.

[16]Saxena S,Dutta A.Geminin-CDT1 balance is critical for genetic stability[J].Mutat Res,2005,569:111.

[17]文川,萬伍卿.細(xì)胞周期相關(guān)因子CDT1和 Geminin的平衡[J].醫(yī)學(xué)與哲學(xué):臨床決策論壇版,2007,3:43.

[18]De Marcoa V,Gillespieb PJ,Li A,et al.Quaternary structure ofthe human CDT1-Geminin complex regulates DNA replication licensing[J].PNAS,2009,106(47):19807.

[19]Lutzmann M,Maiorano D,Mechali MA.CDT1-Geminin complex licenses chromatin for DNA replication and prevents rereplication during Sphase in Xenopus[J].EMBO J,2006,25:5764.

[20]孫燕平,萬伍卿.細(xì)胞周期相關(guān)因子CDT1功能的負(fù)調(diào)節(jié)[J].醫(yī)學(xué)臨床研究,2007,24(7):1211.

[21]Senga T,Sivaprasad U,Zhu W,et al.PCNA is a cofactor for CDT1 degradation by CUL4/DDB1-mediated N-terminal ubiquitination[J].J Biol Chem,2006,281:6246.

[22]Hara K,Makayama KI,Nakayama K,et al.Geminin is essential for the development of preimplantation mouse embryos[J].Genes Cells,2006,11:1281.

[23]Luo L,Yang X,Takihara Y,et al.The cell-cycle regulator Geminin inhibits Hox function through direct and polycomb-mediated interactions[J].Nature,2004,427:749.

[24]Nishitani H,Lygerou Z,Nishimoto T.Proteolysis of DNA replication licensing factor CDT1 in S-phase is performed independently of Geminin through its N-terminal region[J].J Biol Chem,2004,279:30807.

[25]楊寧,柳惠圖,張偉.多功能蛋白 Geminin的研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2007,34(9):922.

10.3969/j.issn.1671-8348.2010.24.063

R329.28

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1671-8348(2010)24-3432-03

2010-06-13

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