孫 婷綜述,晏洪波審校

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院皮膚科,武漢430070)

家族性腫瘤樣鈣沉著癥(fam ilial tumoral calcinosis,FTC)是一組常染色體隱性遺傳病。主要病理改變?yōu)檐浗M織異位鈣化,可導致皮膚和骨的2次感染,常伴動脈瘤,牙齒異常,亦可見皮疹。常規(guī)治療手段對該病無穩(wěn)定療效,包括限磷飲食、鈣螯合物(乙二胺四乙酸)、雙磷酸鹽類藥物、皮質類固醇、碳酸酐酶抑制劑(乙酰唑胺)及鈣化組織切除。

1 FTC的分類

FTC的發(fā)病率無確切報道,主要見于中東或非洲裔家族,最近也有少量白人病例報道。目前亞洲人中僅少數(shù)病例個案,未見相關分子遺傳學研究報道。FTC有2種類型:高磷酸血癥型(H FTC,M IM 211900)和正常磷酸血癥型(NFTC,M IM 610455)。

H FTC主要表現(xiàn)為大關節(jié)周圍皮下組織的鈣質沉積,有報道磷酸鈣結晶可達1 kg以上;同時伴甲狀旁腺激素和維生素D代謝產(chǎn)物的異常,繼發(fā)性腎小管及小腸磷重吸收增加,血磷升高顯著[1]。HFTC已有多例關于內臟鈣化的報道[2],但NFTC暫未觀察類似病例。目前發(fā)現(xiàn)與H FTC發(fā)病相關的主要有GALNT3基因、FGF23基因和KLOTHO基因。

NFTC中多見較小鈣化,常發(fā)于組織損傷及炎癥部。有推測其是因炎癥調節(jié)過度導致。該類患者通常伴有炎癥(如結膜炎、牙齦炎)或一系列看似無明顯關聯(lián)的因素,如血管性疾病、癌癥、自身免疫性疾病等;鈣磷代謝及甲狀旁腺激素水平無明顯異常。在Topaz等[3]觀察的5個猶太家庭NFTC病例中,皮損活檢顯示大量磷酸鈣結晶沉積在真皮中部及深部,所有患者早期皮損處均存在紅色素沉著。序列分析提示該病與SAMD9基因突變相關。

2 FTC相關基因

2.1 FGF23基因及其突變分析

2.1.1 FGF23基因及其編碼蛋白 成纖維生長因子23(fibroblastgrow th factor-23,FGF23)是成纖維細胞生長因子家族成員之一,為32×103的 O型糖化蛋白。其與人 FGF21及FGF19分別具有24%和22%的同源性,在N端擁有一個含24個氨基酸的信號肽。人FGF23基因定位于12號染色體p13.3,基因序列跨越10 kb,擁有3個外顯子。FGF23主要表達于骨細胞,遠程調控腎臟磷酸鹽代謝,具有內分泌激素特征。FGF23在胞內首先以無活性形式合成,經(jīng)枯草桿菌樣蛋白轉化酶(SPCs)對介于A rg179和Ser180之間(RHTR179)序列進行胞內加工,最終形成完整地活化形式,包含:一個N端片段,其構成FGF蛋白家族β筒結構(βbarrel);及一個高保守的C端片段。該加工步驟對FGF23的調節(jié)磷平衡功能必不可少。

2.1.2 FGF23與磷酸鹽代謝 FGF23主要通過抑制1α-羥化酶活性及減少鈉-磷共轉運蛋白Ⅱa(NaPiⅡa)表達實現(xiàn)調磷功能。1,25-(OH)2 d3是維生素D3的活化形式,可促進腎小管對磷重吸收。體內維生素D3首先在肝臟被25-羥化酶催化生成25-(OH)2 d3,后者于腎臟經(jīng)1α-羥化酶催化轉變?yōu)?,25-(OH)2 d3。FGF23基因敲除(FGF23-KO)小鼠表現(xiàn)高血磷,腎磷酸鹽重吸收增加和1,25(OH)2d3水平升高,FGF23突變小鼠與其表現(xiàn)類似;當誘導1α-羥化酶突變后,小鼠因血磷升高導致的衰老癥狀得到緩解,說明FGF23是通過抑制1α-羥化酶的活性而實現(xiàn)血磷調節(jié)[4]。NaPiⅡa屬于鈉離子依賴性磷酸鹽協(xié)同運輸因子,嚴格控制腎磷酸鹽重吸收,NaPiⅡa缺陷大鼠腎近端小管的磷重吸收減少80%。給小鼠靜脈注射5μg完整FGF23蛋白,可使8 h內腎臟NaPiⅡa蛋白減少,血磷降低20%～25%。FGF23-KO小鼠在出生6周時,腎近端小管的最大磷轉運率(Tm P/GFR)顯著增加,同時近端小管頂端的NaPiⅡa蛋白水平顯著增加。推測FGF23可促使NaPiⅡa內移和降解,并抑制其表達。

FGF23亦受一個反饋機制的調節(jié)。高磷酸鹽食物或高血磷可使骨骼FGF23表達增加[5],隨之FGF23作用于腎臟靶細胞,最終降低血磷。給大鼠注射大量1,25-(OH)2 d3(增強磷的重吸收而升高血磷)可以顯著升高血清FGF23濃度。相反,當血磷降低,則FGF23表達受抑制,從而活性維生素D3及NaPiⅡa表達增加而血磷升高。這個精密的反饋機制實現(xiàn)了機體穩(wěn)定的血磷環(huán)境。

2.1.3 HFTC中FGF23突變類型 FGF23功能獲得性突變可導致常染色體顯性遺傳低磷血癥性佝僂病(M IM 193100),該病特征為腎小管磷排泄增加和骨量丟失。由于該病多方面代謝特征與HFTC呈鏡像表現(xiàn),研究者提出HFTC與FGF23功能缺陷相關的可能。隨后,多個實驗室均有報道FGF23功能缺失的患者表現(xiàn)出HFTC特征。

綜合目前的病例報告,FGF23基因突變多見于酶切基序中(R176Q,R179Q,R179W)。推測這些突變導致FGF23穩(wěn)定性降低,完整活性FGF23分泌減少。Benet-Pagès等[6]報道了1例新的FGF23基因純合突變(S71G,ser71-to-gly)患者,該突變位于 N-末端β-barrel結構,與酶切位相差約100個氨基酸。患者表現(xiàn)出典型HFTC癥狀及內臟鈣化。這種錯義突變減少/甚至停止了完整FGF23的分泌。2009年 Lammoglia等[7]報道1例3歲高加索女性病例,血磷顯著升高,左肘部大塊鈣化導致皮膚潰瘍;其7個月大的妹妹血磷偏高,但可能由于年齡較小,未觀察到異常鈣化。二者均無齒齦異常發(fā)現(xiàn),而既往認為這一點在確定該病癥是否為遺傳傳播方式時至關重要。序列分析表明,患者為FGF23錯義突變純合子(c.367G 1 T,p.Gly 123 Trp),其父母是突變基因的攜帶者。經(jīng)過磷酸鹽黏合劑司維拉姆(sevelamer)及碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺(acetazolam ide)聯(lián)合治療,患者血磷水平降低,鈣化塊減小。

綜合目前研究資料,HFTC中的FGF23突變多可直接影響到蛋白酶識別位點,導致這些位點O型糖基化減少,因此增強FGF23降解的易感性,或直接降低FCG23活性。針對這一特點,有學者提出通過修復FGF23蛋白結構治療FTC的設想,目前未見深入報道。

2.2 GALNT3基因及其突變分析

2.2.1 GALNT3與磷酸鹽代謝 人GALNT3基因位于21號染色體 q24-q3區(qū)域,該基因全長約 46.49 kb,包含10個外顯子,為多肽N乙酰氨基半乳糖轉移酶(UDP-GalNA c:po lypeptide N-acetylgalactosam iny l-transferase,ppGalNacT)基因家族成員。其負責編碼 UDP-N-乙酰-α-D-氨基半乳糖轉移酶3(ppGalNacT3),由 633個氨基酸組成,各組織廣泛表達,其中胰腺、睪丸高水平表達。ppGalNacT是催化黏蛋白O型糖基化的起始酶,可將糖基供體UDPGalNA c中的GalNac基團轉移至多肽鏈中的絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)羥基上,形成α糖苷鍵。研究證明ppGalNacT家族成員在整個演化過程中高度保守,提示O型糖基化對人類生理的重要性。HFTC是目前惟一已知的由半乳糖轉移酶突變導致的臨床疾病。

ppGalNacT3的調磷機制仍未完全明確。其對FGF23的SPCs識別序列基元選擇性 O型糖基化,這一過程可抑制FGF23降解[8]。GALNT3突變被認為可增加FGF23蛋白水解和/或降低FGF23活性。此外,ppGalNacT3可作用于其他靶分子以影響磷酸鹽水平,如各種磷酸鹽聯(lián)合轉運因子,包括被認為可調控FGF23合成的磷酸鹽調節(jié)因子(PHEX)、牙本質基質蛋白1(DMP1)等[9]。

2.2.2 HFTC中GALNT3突變類型 HFTC病例中GALNT3突變范圍廣泛,包括剪切位點和編碼區(qū),如(GLN 481TER),(IVS1AS,A-T,-2),(ARG 162TER),(IVS7,G-A,+1)(IVS7DS,G-A,+5),(TYR322TER)[10-14],臨床表型各異。

2006年Speck tor[15]報道了1例GALNT3純合型突變(GLN 592TER),患者為一名北歐男性,有嚴重的關節(jié)病和齒齦異常癥狀,實驗室檢測符合 H FTC診斷。該報道提示HFTC具有較以往構想更廣泛的地理分布。Kelly等[16]對一非洲裔HFTC家族進行近40年臨床觀察,父母健康,16個子女中7人受累,隨后的子輩13人和孫輩7人無HFTC臨床表現(xiàn)?；颊逩ALNT3基因出現(xiàn)外顯子1的無義突變(484C-T),及外顯子7雜合突變(IVS7+5G-A,ARG162TER)。7例患者癥狀輕重不一,40年間分別經(jīng)歷了4～36次手術治療,復發(fā)率高。其中3名患者出現(xiàn)該病的靜止期(7年,12年和15年)。由此可見,相同的突變位點在家族發(fā)病成員中表型差異巨大。這說明基因突變位點與表型存在復雜的關系。同時提示,雖然傳統(tǒng)認為出現(xiàn)H FTC至少需要雙等位基因突變,但是1個基因突變就足夠導致生化異常。

于是,有學者對HFTC的常染色體隱性遺傳方式提出質疑。Ichikawa等[12]對一個HFTC患者家族的GALNT3基因進行了突變分析,確認內含子1存在新的剪切點突變(IVS1-2a3t)。先證者是該剪接位點雜合突變與一無義雜合突變的復合型(484C3T;R162X),其舅舅攜帶剪接位點純合突變,也表現(xiàn)出HFTC癥狀。進一步分析這個家族中的GALNT3基因序列,發(fā)現(xiàn)2個典型 HFTC表型者(Ⅱ-5和Ⅳ-6)攜帶了雙等位基因的突變(R162X和或ⅣS1-2a3t)。R162X的突變可能導致翻譯提前終止。剪接位點的突變會導致外顯子2的缺失,從而刪除GALNT3蛋白的關鍵部分。這似乎提示該家族有準常染色體顯性遺傳病,即GALNT3雜合突變可導致生理異常。

2006年Ichikawa等[17]報道1例25歲女性患者,呈現(xiàn)眼瞼鈣化及高磷血癥。該患者既往無相關病史,X線檢查無異位鈣化,僅表現(xiàn)出更多與其年齡不符的鈣化肋軟骨?；颊逩ALNT3突變出現(xiàn)在外顯子 3(T272K)和5(T359K)。既往HFTC病例中均未發(fā)現(xiàn)孤立眼瞼鈣化。這一發(fā)現(xiàn)提示:可能有一系列弱表型存在;H FTC發(fā)病也許較以往學者想象的更為普遍。但不能排除這些患者的狀況有繼續(xù)惡化的可能。

隨后 Ichikaw a等[18]觀察了 1例GALNT3突變導致的骨肥厚-高磷酸鹽綜合征(HHS)。X線檢查顯示,這位5歲的法籍男孩腿部骨骼增生,并導致皮膚病變。皮損組織由不成熟小梁結構和纖維組織包繞的編織骨組成。與HFTC相似的是:完整FGF23血清水平低于正常,FGF23 C末端明顯升高。由此有研究者提出,HHS和HFTC是同一種疾病的不同表現(xiàn)型。

2.3 K lotho基因及其突變分析

2.3.1 K lotho主要功能 1997年Matsumura等在研究老年性疾病時從小鼠模型中克隆出與衰老相關的基因,即K lotho(KL)基因。人KL基因定位于13號染色體q12,全長約50 kb,包含5個外顯子和4個內含子。KL基因的操縱子內沒有TA TA盒和CAAT盒,但有5個潛在的sp1結合位點,外顯子1及其側翼序列存在 CPG島。研究表明,KL基因結構中,mRNA存在一個選擇性RNA剪切位點,該位點如果接受了一個50 bp片段的插入,該插入序列末尾2個核苷酸TA就會與外顯子4的第1個核苷酸G構成終止密碼TAG,形成一個短的開發(fā)閱讀框,僅3個外顯子和2個內含子參與編碼形成分泌型KL蛋白。如果缺乏這個50 bp的插入序列,其mRNA就是完整結構,編碼形成一種膜型KL蛋白。膜型K L蛋白由1 012個氨基酸組成,為單跨膜蛋白,包括1個N末端信號序列,1個單跨膜區(qū),1個短的胞內區(qū),及由2個與β-葡萄糖苷酶有20%～40%同源性的內部重復片段KL1和KL2組成的胞外區(qū)。其中KL1和 KL2蛋由保守序列 Lys-Lys-A rg-Lys連接在一起,可能是蛋白酶裂解位點,該位點可釋放小肽作為體液因子發(fā)揮作用。由549個氨基酸組成的分泌型KL蛋白僅含N末端序列和K L1胞外區(qū)。人K L基因廣泛表達,其中分泌型KL蛋白在所有被檢組織均占表達優(yōu)勢。

最初研究表明K L蛋白是一種與年齡、衰老性疾病密切相關的抗衰老因子。KL基因缺失小鼠會出現(xiàn)骨質減少、皮膚和肌肉萎縮、肺氣腫、不育、軟組織鈣化和60 d內死亡等典型早衰癥狀。KL表達不足的小鼠生化異常包括:血磷及血鈣升高,低血糖和1,25(OH)2 d3血清濃度升高。該表型與FGF23失活小鼠模型癥狀相似;這指示KL和FGF23有明顯功能交叉。隨后的體內、體外實驗證明,KL參與介導FGF23信號傳導途徑[19]。腎勻漿實驗發(fā)現(xiàn),KL可與FGF23結合;體外培養(yǎng)腎細胞的KL強行表達可使FGF23與細胞表面親和力升高,并恢復了腎細胞系FGF23的應答能力;隨后對小鼠注射野生型KL單克隆抗體,小鼠FGF23功能缺失。這一系列發(fā)現(xiàn)提示KL對內源性FGF23功能必不可少。但單由KL似乎無法得到細胞內信號,U rakaw a進一步發(fā)現(xiàn)FGF23受體的另一元件(FGFR1(Ⅲc)),通過KL直接轉換為FGF23受體。即KL和FGFR1(Ⅲc)協(xié)同作用,重組形成 FGF23受體。

2.3.2 HFTC中KL基因突變類型 2007年Ichikaw a等[20]報道了第 1例 KL基因純合型突變(H IS193ARG)導致的H FTC?；颊邽橐幻?3歲女性,外踝和魚際肌輕度腫脹,無發(fā)紅、發(fā)熱。實驗室檢查顯示,血磷升高,FGF23活性增加,血清鈣和甲狀旁腺激素亦有升高。X線片顯示,骨質疏松,多處鈣化斑塊,顱內、硬腦膜和頸總動脈均有鈣化。通過不完全性甲狀旁腺腺體增生治療,患者癥狀緩解。

KL基因突變導致HFTC與FGF23信號傳遞有明顯關聯(lián)。但KL突變患者未出現(xiàn)類似于KL表達不足小鼠的早衰癥狀,人類可能通過某種方式減少KL的功能缺失對其他代謝過程的影響。KL基因對鈣、磷代謝的影響還需要通過更多病例觀察以明確。

2.4 SAMD9基因及其突變分析 人SAMD9基因定位于7號染色體q21-q21.3,包含3個外顯子。啟動子區(qū)域包含TATA信號盒和淋巴細胞增強因子(LEF)的結合元件,并有多個選擇性轉錄起始位點,腺苷酸多聚位點和至少2個選擇性剪切位點。SAMD9蛋白由1 589個氨基酸組成,組織表達范圍廣泛,包括皮膚,而以血管內皮細胞表達強度較高,其次為成纖維細胞。除SAMD9L蛋白外,SAMD9與極少的蛋白具有同源性。實驗證明,SAMD9在維持細胞活力與增殖,誘導細胞凋亡、腫瘤生長等方面均有重要作用[21]。亦有數(shù)據(jù)證實SAMD9通過TGF-β信號轉導通路參與骨外鈣化的調節(jié)[22]。

2006年 Topaz等[23]第1次報道了8例與SAMD9相關的NTFC,呈 SAMD9突變純合型(K 1495E,LYS1495GLU),均為也門猶太裔。K 1495跨物種高度保守性質提示該位點的生理重要性。2008年Topaz等[22]再次對另一也門猶太裔家族的NTFC病例進行評估,患者均為K 1495E和R344X(一種既往無報道的無義突變)的復合性雜合突變型,預計將產(chǎn)生顯著的截短分子?？紤]到NTFC的罕見和也門猶太裔族群的小規(guī)模,SAMD 9基因突變也可能是基因漂變和種族差異性修飾的反應。目前關于SAMD9功能仍未探明,SAMD9在調節(jié)鈣磷平衡中的功能還有待觀察。

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