劉 宏綜述,鄧明明審校

(瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,四川瀘州646000)

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡,是局部環(huán)境生理或病理性變化引起的、由自身內(nèi)部機制調(diào)節(jié)的一種主動的并按一定程序進行的細胞自發(fā)性死亡方式。重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)過程中血清、腹水及肝臟各種原因造成的肝損傷都可以出現(xiàn)肝細胞凋亡,肝細胞凋亡是肝臟損傷的表現(xiàn)及機制之一,大量的肝細胞凋亡可造成肝功能障礙,嚴重時可發(fā)展至肝衰竭。因此,了解重癥胰腺炎時肝細胞凋亡的機制將有利于重癥胰腺炎肝臟損傷的預防及治療。

1 胰腺炎時引起肝細胞凋亡因素

1.1 胰腺炎相關性腹水(pancreatitis.associated ascitic fluid,PAAF) 近年來發(fā)現(xiàn)胰腺炎相關性腹水在胰腺炎肝臟損傷肝細胞凋亡中有著重要的作用,在急性胰腺炎(acute pencreatitis,AP)時形成腹水不僅作為一種損傷體征出現(xiàn),而且具有很強的致病性,可以促使AP病情進一步加劇,并造成胰外器官的損害。

Takeyama[1]通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)胰腺炎相關性腹水能夠?qū)е路闻萆掀ぜ毎⒛I小管上皮細胞及肝細胞等器官的薄壁細胞凋亡,并導致急性重癥胰腺炎器官功能不全。細胞的凋亡數(shù)影響重癥胰腺炎的死亡率及發(fā)病率,控制細胞的凋亡對改善重癥胰腺炎的臨床愈后有重要的意義。Yang等[2]又進一步發(fā)現(xiàn),向大鼠靜脈滴注滅菌的PAAF,同時將離體人肝細胞株(CCL-13)暴露于PAFF 24 h后,大鼠血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)水平和肝細胞凋亡的數(shù)量都明顯增加。在 CCL-13中檢測到p38-促分裂原活化蛋白激酶(p38-m itogen-activated p rotein kinase,p38-MAPK)的激活,細胞凋亡出現(xiàn)了時間和劑量的依賴性,而caspase-3抑制劑Ⅱ可以減少凋亡。故而認為PAAF通過p38-MAPK的激活和caspase-3依賴的途徑引起肝細胞凋亡從而造成了肝損傷。同時也有學者認為,PAAF通過其含有的細胞毒性物質(zhì)造成了肝細胞凋亡,并發(fā)現(xiàn)PAAF導致肝細胞酸中毒、細胞內(nèi)鈉潴留、線粒體內(nèi)ATP耗竭等,并認為PAAF中含有的血色素可能是造成肝臟損傷的細胞毒性物質(zhì)之一,PAAF可造成肝細胞內(nèi)鈣超載。這也可能是AP時肝臟受損以及AP造成多器官功能損傷的原因之一。

1.2 彈性蛋白酶 在正常情況下,胰液內(nèi)的胰蛋白酶原無活性,待其流入十二指腸,受到膽汁和腸液中的腸激酶(enterodinase)的激活作用后乃變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌?。胰腺炎時因某些因素激活了胰蛋白酶,后者又激活了其他酶反應,如胰蛋白酶對由脂蛋白構成的細胞膜及線粒體膜并無作用,而胰液中的磷脂酶A被脫氧膽酸激活后,作用于細胞膜和線粒體膜的甘油磷脂,使之分解變?yōu)槊撝崧蚜字?亦稱溶血卵磷脂(lysolecithin),后者對細胞膜有強烈的溶解作用,可溶解、破壞胰腺細胞膜和線粒體膜的脂蛋白結(jié)構,致細胞凋亡壞死。

Sha等[3]和趙萬蓉[4]認為胰蛋白酶是SAP多器官功能障礙的罪魁禍首。彈性蛋白酶正常存在于胰腺腺泡細胞的酶原顆粒和胰液中,被胰蛋白酶激活后水解彈力纖維和多種其他蛋白質(zhì).是消化破壞血管壁的關鍵酶,使血管壁水腫、出血、微循環(huán)障礙,從而造成患者早期循環(huán)紊亂,多臟器出血、血性胸腔積液及腹水。這種病理變化最明顯的是肝臟,因為肝臟是第一個接受最高濃度的胰蛋白酶靜脈血流的器官。M urr等[5]利用含胰彈性蛋白酶(1 u/m L)和/或釓(0.5 mg/m L)的灌洗液灌洗鼠的肝臟,胰彈性蛋白酶可以使流出液中AST、ALT、LDH、腫瘤壞死因子(TNF)和細胞壞死凋亡率升高,且組織中TNF-m RNA表達也增加,而釓則可以減弱彈性蛋白酶的這些作用。

由此可見,彈性蛋白酶可以導致類似 AP時的肝損害表現(xiàn),與彈性蛋白酶的激活可導致ASP時急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發(fā)生是一致的,由此而認為彈性蛋白酶是AP時全身多器官衰竭中導致炎癥細胞廣泛激活的重要因子。

1.3 細胞內(nèi)Ca2+超負荷 細胞內(nèi)Ca2+是重要的第二信使,參與細胞的多種生理功能,一旦超負荷將從多方面對細胞造成不可逆的損傷和促凋亡作用。Ueda等[6]用熒光鈣離子指示劑Fluo-2/AM檢測PAAF原代培養(yǎng)的人肝細胞,發(fā)現(xiàn)PAAF可以增加細胞內(nèi)Ca2+,且在加入PAAF 1 m in后就有細胞內(nèi)Ca2+的增加。對PAAF成分分析發(fā)現(xiàn),只有分子質(zhì)量在5×104及其以上的成分同時具有升高細胞內(nèi)Ca2+和細胞毒性的特性。且細胞內(nèi)Ca2+釋放阻滯劑(TMB-8)和毒胡蘿卜素都不能抑制PAAF導致的細胞內(nèi)Ca2+升高,細胞外Ca2+螯合劑EGTA則能抑制細胞內(nèi)Ca2+升高。這意味著細胞內(nèi)Ca2+的增加是由細胞外向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運所致。血小板活化因子受體抑制劑(TCV-309)也有阻斷作用;胰腺炎相關性血清也有升高細胞內(nèi)Ca2+的作用,由此認為血小板活化因子在細胞內(nèi)Ca2+升高中可能發(fā)揮著中心環(huán)節(jié)的作用。1.4 氧化劑誘導肝細胞凋亡 氧自由基(oxygen free radical,OFR)是指氧的某些代謝產(chǎn)物和一些反應的含氧產(chǎn)物,包括超氧陰離子、羥自由基以及其與多不飽和脂肪酸作用后衍生的烷自由基、烷氧自由基、烷過氧自由基、H2O2等統(tǒng)稱為活性氧(reactive oxygen species,ROS)。正常時機體內(nèi)自由基產(chǎn)生極少,且有抗氧化防御系統(tǒng)與之對抗,不會對機體造成損傷。但在病理條件下,如缺血、缺氧、炎癥介質(zhì)釋放激活中性粒細胞(PMN)時可大量產(chǎn)生OFR,造成機體的廣泛損傷?，F(xiàn)已證實,在AP時過度的炎癥反應產(chǎn)生大量的細胞因子、血管活性因子,如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、血栓素A 2(TXA 2)和前列環(huán)素(PGI2)在微循環(huán)障礙中起重要作用。另外,由于炎癥介質(zhì)的作用,PMN在各種組織和器官內(nèi)聚集、活化,眾多原因均導致OFR以上述途徑大量釋放[7]。

已注意到細胞暴露于低水平的氧化劑中容易激發(fā)凋亡,如低濃度的過氧化氫可誘導細胞的凋亡,高濃度的則可誘發(fā)壞死。

由于肝臟特殊的解剖位置及功能,重癥胰腺炎時富含OFR物質(zhì)的靜脈血經(jīng)門靜脈到達肝臟引起肝細胞的凋亡從而引起肝細胞損傷,SAP患者幾乎很早都有肝功能異常表現(xiàn)。

1.5 線粒體功能狀態(tài)與凋亡相關 線粒體在肝細胞凋亡中發(fā)揮重要作用,細胞受到凋亡信號刺激后,線粒體發(fā)生腫脹,位于線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔道(m itochondriumpermeability transition pore,MPTP)開放,使線粒體外膜電位降低、破裂,線粒體內(nèi)細胞色素C(cy tochrome C,Cyt C)、凋亡誘導因子(apop/osis.inducing factor,A IF)、Ca2+以及活性氧等釋放到胞質(zhì)中,分別通過破壞核內(nèi)染色質(zhì)或激活caspase或作用于其他Ca2+依賴性蛋白,而引起細胞凋亡。

線粒體通過釋放出凋亡誘導因子和/或細胞色素C誘導凋亡。如線粒體內(nèi)膜發(fā)生損傷,則可導致線粒體功能的改變和肝細胞壞死 。另外,一系列的單細胞的研究發(fā)現(xiàn),在缺氧或高氧的情況下,激活線粒體的滲透轉(zhuǎn)換能力能促進細胞死亡[8]。

研究發(fā)現(xiàn)狗和人的PAAF均可以增加離體培養(yǎng)的鼠肝細胞線粒體呼吸的氧消耗率。并且人的PAAF增加耗氧率的作用更大,線粒體的ATP酶也被激活。進一步研究認為PAAF中的血紅蛋白是導致肝細胞損害的主要物質(zhì)之一。血紅蛋白可能是實驗中PAAF中存在的可透析性的線粒體毒性物質(zhì)之一,通過干擾線粒體呼吸功能,導致肝細胞內(nèi)環(huán)境平衡和能量代謝失衡,參與SAP時肝細胞的損害。

2 凋亡相關基因的調(diào)控

2.1 Bax和Bcl-2 實驗發(fā)現(xiàn),SAP大鼠肝臟的細胞凋亡數(shù)明顯增多,凋亡指數(shù)增高,凋亡發(fā)生部位與病理改變明顯的部位吻合,肝臟細胞凋亡指數(shù)與肝功能的損害程度呈正相關,說明SAP肝臟損傷至少部分是通過細胞凋亡機制引起的,而且細胞凋亡是造成肝功能進一步惡化的重要因素之一。細胞凋亡調(diào)控基因中最受關注的就是Bcb-2家族,其中Bcb-2和Pax都是Bcl-2家族成員,Bcl-2的生理功能主要是抑制細胞凋亡,延長細胞壽命。Bcl-2與Bax可形成同二聚體或異二聚體來改變線粒體的通透性,從而決定細胞的生存與死亡。當Bcl-2相對量高于Bax時,Bcl-2同二聚體增多并促進形成Bcl-2-Bax異二聚體,而Bcl-2同二聚體和Bcl-2-Bax異二聚體都可抑制細胞凋亡;相反當Bax的量相對高于Bc1-2時,則Bax同二聚體增多,從而促進細胞凋亡[9]。因而Bcl-2/Bax兩蛋白的比例是決定細胞凋亡或存活的關鍵因素[10]。除此以外,Bcl-2還可以通過直接或間接的影響細胞信號傳遞蛋白,如抑制WTp53介導的細胞凋亡[11]。而應用DDFA(D:地塞米松,D;低分子右旋糖酐,F:5-氟脲嘧啶,A;抑肽酶)治療后,Bax基因表達明顯下調(diào),而Bel-2基因表達明顯上調(diào),Bel-2/Bax比值上升。SAP時隨著肝臟凋亡細胞數(shù)增多、Bax基因表達明顯上升,Bel-2的表達下調(diào),肝功能進一步惡化,DDFA使Bax基因表達明顯下調(diào),而Bel-2基因表達明顯上調(diào),減少肝臟細胞凋亡可明顯改善肝功能。因此認為,DDFA對肝功能的保護作用可能部分是通過調(diào)節(jié)凋亡相關基因Bax和Bcl-2從而影響細胞凋亡實現(xiàn)的[12]。

2.2 轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1) TGF-β1是一種廣泛存在的生長抑制因子,可抑制肝細胞、胃腸道上皮細胞等多種上皮細胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn),在肝臟、枯否細胞、竇狀內(nèi)皮細胞、貯脂細胞和竇周細胞均表達TGF-β1。雖然正常肝臟細胞或剛分離的新鮮肝細胞不表達 TGF-β1的m RNA或蛋白,但培養(yǎng)后的肝細胞和肝細胞瘤中的細胞可獲得表達TGF-β1的能力,另外肝臟處于其他疾病時也可檢測到有TGF-β1生成,而且和肝細胞的凋亡密切相關。Kusaka等[13]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1的含量與肝細胞的凋亡數(shù)成正比。Nakamura等[14]發(fā)現(xiàn),大鼠AP時TGF-β1在血漿、PAAF、肝組織和腹膜巨噬細胞中的水平都升高,其中和抗體可以減少肝細胞的凋亡,降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶,而巨噬細胞的清除明顯降低了血漿和PAAF中TGF-β1蛋白的水平,且明顯抑制了肝組織中 TGF-β1的激活。因此認為,AP肝損傷與巨噬細胞引起的凋亡有關,而其衍生的TGF-β1是誘導肝細胞凋亡的重要因子。有研究同時發(fā)現(xiàn)急性出血壞死性胰腺炎(ANP)時PAAF、血漿和肝組織中有較高的TGF-β1濃度,用TGF-β1抗體中和技術可以減少肝細胞的凋亡?？梢奝AAF中的 TGF-β1由腹膜巨噬細胞產(chǎn)生,也可經(jīng)腹膜吸收入血,從而介導遠隔臟器細胞的凋亡。

2.3 Kup ffer細胞與Fas/FasL基因 研究發(fā)現(xiàn),AP時Kupffer細胞衍生的 Fas配體(FasL1、p38-M APK)、caspase-3表達增加,并且誘導了肝細胞的凋亡損傷[15-16]。Gallagher等[17]又進一步發(fā)現(xiàn),在Fas/FasL基因敲除大鼠中,AP誘導的p38-MAPK表達顯著降低,肝細胞的凋亡也明顯減少。推測Fas/FasL在AP肝細胞的凋亡中起關鍵作用。Peng等[18]通過膽堿缺乏和乙硫氨酸補充飲食(CDE)誘導大鼠AP模型,并用胰彈性蛋白酶在p65 siRNA轉(zhuǎn)染的大鼠離體Kup ffer細胞株中模擬AP損傷模型,實驗發(fā)現(xiàn)CDE胰腺炎引起p65 NF-kappa B/RelA核轉(zhuǎn)位、Fas/FasL和caspase-3表達增加以及大鼠肝細胞核內(nèi)DNA斷裂。而在體外實驗中,p65-siRNA的轉(zhuǎn)染減弱了彈性蛋白酶誘導的p65 NF-kappa B/RelA核轉(zhuǎn)位和Kupfer細胞的凋亡,證明 AP通過 NF-kappa B途徑誘導Kupffer細胞凋亡,并認為 Kup ffer細胞衍生的Fas/FasL誘導的肝細胞凋亡和NF-kappa B途徑誘導的Kup ffer細胞凋亡之間的平衡失調(diào)程度決定了AP時肝臟損傷的程度。

3 阻斷肝細胞過度凋亡在重癥胰腺炎肝損傷中的應用前景

肝細胞凋亡在重癥胰腺炎肝臟損傷中發(fā)揮著重要的作用。重癥胰腺炎時機體通過多種途徑導致肝細胞的凋亡,其中以PAAF的毒性作用及氧自由基損傷和缺血損傷占有重要的作用。大量實驗研究發(fā)現(xiàn),重癥胰腺炎時肝臟的損傷情況與肝細胞的凋亡呈正相關,且組織損傷與病理改變相符合。對于肝細胞凋亡在重癥胰腺炎時肝臟損傷中作用的認識,促使人們探討新的阻止肝細胞死亡的方法來治療及預防重癥胰腺炎對肝臟的損傷。有研究發(fā)現(xiàn),對重癥肝炎的小鼠注射抑制caspase蛋白酶核心的三肽,可以阻止肝細胞凋亡和肝功能衰竭的發(fā)生,使小鼠的肝臟功能改善。熊去氧膽酸可通過結(jié)合并排出有毒的膽鹽阻止凋亡,這種膽鹽存在于鼠的肝細胞線粒體中,可以阻止線粒體的滲透性轉(zhuǎn)換,保護線粒體功能。

如何阻止肝細胞的過度凋亡,將成為治療重癥胰腺炎肝臟損傷及肝病研究領域的新的熱點,也將為胰腺炎肝臟損傷的治療帶來新的方法。

[1]Takeyama Y.Significance o f apop totic cell death in system ic comp lications with severe acute pancreatitis[J].J Gastroenterol,2005,40(1):1.

[2]Yang J,Fier A,Carter Y,et a l.Liver iniury during acute pancreatitis:the role of pancreatitis-associated ascitic fluid(PAAF),p38-MAPK,and caspase-3 in inducing hepatocyte apoptosis[J].JGastrointest Surg,2003,7:200.

[3]Sha H,M a Q,Jha RK.Trypsin is the cu lp rit of mu ltip le organ in jury with severe acute pancreatitis[J].Med Hypotheses,2009,72(2):180.

[4]趙萬蓉.急性重癥胰腺炎診斷治療進展——診斷和內(nèi)科治療[J].重慶醫(yī)學,1996,25(5):300.

[5]Murr MM,Yang J,Fier A,et al.Pancreatic elastase induces liver injury by activating cy tokine p roduc tion w ithin Kupffer cells via nuclear factor-Kappa[J].B JGastrointest Surg,2002,6(3):474.

[6]Ueda T,Takeyama Y,Takase K,et al.H ematin is one of the cy totoxic factors in pancreatitis-associated ascitic fluid that causes hepatocellular injury[J].Surgery,2002,131(1):66.

[7]白啟軒,馮子壇,于蘭,等.氧化損傷與急性胰腺炎所致多臟器損傷的研究進展[J].臨床誤診誤治,2006,19(11):71.

[8]肖經(jīng)緯.肝細胞凋亡機制及其檢測方法的研究進展[J].國外醫(yī)學衛(wèi)生學分冊,2006,33(2):93.

[9]Yu XD,Wang SY,Chen GA,et al.Apoptosis induced bv depsipeptide FK228 coincides with inhibition of survival signaling in lung cancer cells[J].Cancer J,2007,13:105.

[10]Jung JW,Cho SD,Ahn NS,etal.Augmentation of sodium buty rate-induced apop tosis by p38M AP kinase inhibition in rat liver epithelial cells[J].Antioxid Redox Sienaf,2005,7:1767.

[11]張毓芳,劉恩橋.細胞凋亡與心血管疾病研究進展[J].中國心血管雜志,2004,9:385.

[12]何鄒駿,方馳華,朱明德.DDFA對重癥急性胰腺炎大鼠肝臟細胞凋亡及Bax、Bcl-2基因表達的影響[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2006,15(2):220.

[13]Kusaka K,Imamura H,Tomiya T,et al.Exp ression of transform ing grow th factor-alpha and-beta in hepatic lobes after hemihepatic portal vein embolization[J].Dig Dis Sci,2006,51(8):1404.

[14]Nakamura H,Tashiro M,Yamaguchi T,et al.Preferential increase o f extracellu lar matrix exp ression relative to transforming grow th factor beta1 in the pancreas during the early stage of acute hemorrhagic pancreatitis in rats[J].Pancreas,2007,35:e23.

[15]Gallagher SF,Yang I,Baksh K,et a l.A cute pancreatitis induces FasL gene exp ression and apoptosis in the liver[J].Surg Res,2004,122:201.

[16]Yang J,Gallagher SF,Haines J,et al.Kup fer cell-derived Fas ligan d p lays a role in liver uryan dhepatocy te death[J].Gastrointest Surg,2004,8:166.

[17]Gallagher SF,Peng Y,Haines K,et al.Fas/FasL p lay a central ro le in pancreatitis-induced hepatocyte apop tosis[J].Gastrointest Surg,2005,9:467.

[18]Peng Y,Gallagher SF,Landmann R,etal.The ro le of p65 NF.kappaB/RelA in pancreatitis induced Kupffer cellapoptosis[J].R Gastrointest Surg,2006,10:837.