任學(xué)群,李宜雄

(1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院 普通外科,河南 開封 475000;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 普通外科,湖南 長沙 410008)

黃芩素對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)能力的影響

任學(xué)群1,李宜雄2*

(1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院 普通外科,河南 開封 475000;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 普通外科,湖南 長沙 410008)

目的:探討黃芩素對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)能力的影響及其機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞,運(yùn)用MT T法、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)(Wound healing assay)、掃描電鏡和 Transwell實(shí)驗(yàn)等方法,觀察黃芩素對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖、偽足形成、侵襲和遷移能力的影響,并運(yùn)用Western印跡分析、RT-PCR檢測黃芩素干預(yù)后腫瘤細(xì)胞Ezrin蛋白、磷酸化Ezrin蛋白及Ezrin mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果:黃芩素呈時(shí)間和劑量依賴性抑制PANC-1細(xì)胞增殖,使腫瘤細(xì)胞偽足形成顯著減少,細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力下降。Western印跡分析和 RTPCR結(jié)果顯示,黃芩素明顯下調(diào)Ezrin-mRNA和Ezrin蛋白表達(dá)及其磷酸化活化。結(jié)論:黃芩素抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖及運(yùn)動(dòng)侵襲能力,可能與其抑制腫瘤細(xì)胞Ezrin表達(dá)及活化有關(guān)。

Ezrin;胰腺癌;黃芩素

近年來,廣泛存在于自然界植物中的黃酮類化合物因低毒且具有多種生物活性而逐漸引起學(xué)者們的關(guān)注,尤其是其大多數(shù)具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,正日益成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。黃芩素是黃芩干燥根中提取的黃酮類化合物。研究表明:黃芩素是選擇性12-脂氧酶(12-lipoxygenase,12-LOX)抑制劑,具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤新生血管生成、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性等作用,具有廣譜的抗腫瘤生物活性。此外,黃芩素還具有抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用,但機(jī)制不明。

作者前期的研究顯示,Ezrin在胰腺癌細(xì)胞惡性增殖和運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用,且下調(diào)其表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的惡性增殖及侵襲遷移能力。本研究中,作者以體外培養(yǎng)的人胰腺癌PANC-1細(xì)胞株為研究對象,觀察黃芩素對腫瘤細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)侵襲能力及Ezrin表達(dá)或活性的影響,探討黃芩素抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胰腺導(dǎo)管癌PANC-1細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所,用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、10 mmol/L 的HEPES、10萬 U/L 的青霉素、100mg/L的鏈霉素和4 μmol/L谷氨酰胺的DEME培養(yǎng)基置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測細(xì)胞增殖

用無水乙醇將黃芩素(購自南京替斯艾么中藥研究所,HPLC≥98%)稀釋成濃度梯度為:1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μmol/L,共 6 個(gè)梯度。取對數(shù)生長期的細(xì)胞常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液,并調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL,接種于 96 孔板中,每孔培養(yǎng)液 200μL。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后,加入上述各濃度的黃芩素(總體積200 μ L/孔),乙醇對照組加等體積無水乙醇,空白組加等體積培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后,開始MTT反應(yīng),570nm波長下檢測每孔吸光值(OD)。連續(xù)測72 h,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率:細(xì)胞生長抑制率(IR)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。并以抑制率為縱軸,分別以濃度對數(shù)、不同濃度梯度和時(shí)間為橫軸,繪制直線回歸曲線、48 h濃度依賴曲線和時(shí)間-濃度量效曲線,用直線回歸法推算黃芩素作用的50%抑制濃度(IC50),為下面的實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1.3 Western印跡分析

加小劑量黃芩素(5、10μmol/L)培養(yǎng) 48h 后 ,提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用含50 g/L的脫脂奶粉的封閉液封閉1h,轉(zhuǎn)入4℃封閉過夜。加入1:1000稀釋的鼠抗人Ezrin單克隆抗體、鼠抗人磷酸化Ezrin單克隆抗體(美國Upstate公司)或鼠抗人-actin單克隆抗體(美國Abcam公司),4℃孵育過夜;洗一抗,加1:3000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG(美國Sant-Cruz公司),室溫孵育2 h,洗二抗,ECL顯影,觀察,攝片。應(yīng)用Quantity one軟件進(jìn)行定量分析。

1.4 細(xì)胞總RNA提取及RT-PCR

對數(shù)生長期細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,分別加入5.0、10.0 μmol/L黃芩素繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞,Trizol(美國 Invitrogen公司)法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄出cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng),瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行電泳條帶分析。各步驟按說明書進(jìn)行。引物設(shè)計(jì)和合成委托上海吉?jiǎng)P公司完成,引物終濃度為2 μmol/L。引物序列:Ezrin上游:5′-CTCATCCAGGACATCACCCA-3′,下游 :5′-TCACTCCAAGGAAAGCCAAT-3′,擴(kuò)增片段長度為 450 bp;內(nèi)參 β-actin 上游 :5′-GACAGGATGCAGAAGGAGAT-3′,下游 :5′-TGTGTGGACTTGGGAGAGGACT-3′,擴(kuò)增片段長度為550 bp。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性10min,94℃變性45 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。Ezrin mRNA的相對表達(dá)量以Ezrin RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶的光密度值與β-actin的光密度值的比值表示。

1.5 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞周期和凋亡

細(xì)胞用分別含 5.0、10.0 μmol/L黃芩素培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,收集各組細(xì)胞1×106個(gè),體積分?jǐn)?shù)為70%冰乙醇固定,碘化丙錠(PI)染色,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。

1.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)(Wound healing assay)

細(xì)胞按2×105/孔接種于6孔板,加入含DMSO的無血清DMEM培養(yǎng)3 h,使細(xì)胞呈現(xiàn)出單層貼壁生長狀態(tài)。用200 μ L的tip頭給6孔板中的細(xì)胞劃痕,然后改用含2 g/L G418和體積分?jǐn)?shù)為10%FBS且分別含5.0 μmol/L 、10.0 μmol/L 黃芩素的DMEM,在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。分別于劃痕后0、24 h、48 h給細(xì)胞拍照,觀察劃痕愈合能力,每組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)3個(gè)樣本,重復(fù)3次。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力

采用孔徑為8 μ m的24孔Borden小室(美國BD公司),加1:30稀釋的Matrigel膠(美國BD公司)100 μ L制作人工基底膜。用含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS且分別含 5.0 μmol/L 、10.0 μmol/L 黃芩素的 DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù),上室中加入2×105個(gè)細(xì)胞,總體積200 μ L,下室中加入600 μ L 含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中孵育40 h后結(jié)晶紫染色,200倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù),取其平均值作為穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)量。

1.8 掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞偽足

用含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS且分別含5.0 μmol/L、10.0 μmol/L黃芩素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞鋪片,體積分?jǐn)?shù)為 2.5%戊二醛固定。按照掃描電鏡標(biāo)本處理程序進(jìn)行標(biāo)本制備,在掃描電鏡(HITACHI R-250)下觀察細(xì)胞偽足形態(tài)和數(shù)量。在2000倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)細(xì)胞作偽足計(jì)數(shù),取其平均值作為該細(xì)胞的偽足數(shù),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,重復(fù)測量的計(jì)量資料采用重復(fù)測量的方差分析進(jìn)行檢驗(yàn),其他資料用單因素方差分析或t檢驗(yàn),所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn),并以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對PANC-1細(xì)胞增殖的影響

黃芩素對PANC-1細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用,同一時(shí)相各劑量組間、同一劑量組不同時(shí)相間比較差異均有顯著性(P＜0.01),呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性,見表1、圖1。

表1 黃芩素對PANC-1細(xì)胞增殖的影響(%,,n=6)

表1 黃芩素對PANC-1細(xì)胞增殖的影響(%,,n=6)

黃芩素/μmol? L-1抑制率/%24h 48h 72h 000011.51±0.62 2.33±0.91 8.17±1.8525.33±1.35 10.23±2.44 24.67±4.4348.82±1.31 13.82±4.74 31.43±3.79821.64±1.83 43.52±6.81 76.13±1.8016 37.99±1.99 53.63±5.34 85.54±7.0632 51.35±4.38 82.63±7.79 91.88±8.43

選擇48 h時(shí),以細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo),以黃芩素濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),應(yīng)用Excel 2300做出半對數(shù)曲線,建立的回歸線性方程為:y=32.704x+10.567,r為0.9003(P=0.000),建立的回歸方程有意義。并根據(jù)此方程計(jì)算出48 h時(shí)黃芩素對PANC-1細(xì)胞增殖的IC 50是16.0694 μmol/L,見圖2,3。

圖1 黃芩素對PANC-1細(xì)胞時(shí)間-劑量增殖抑制曲線(B1～ B6 分別為黃芩素 1、2、4、8、16、32μmol/L)

圖2 黃芩素48h對PANC-1細(xì)胞劑量增殖抑制曲線

圖3 48h黃芩素對PANC-1細(xì)胞增殖抑制作用的半對數(shù)曲線

2.2 Western blot檢測黃芩素對 PANC-1細(xì)胞Ezrin和磷酸化Ezrin蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)MTT比色法檢測結(jié)果而求出的48h時(shí)黃芩素對PANC-1細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50),我們用小劑量黃芩素(5、10 μmol/L)處理48h后 ,分別提取細(xì)胞總蛋白用于Western blot檢測。結(jié)果顯示:5μmol/L黃芩素培養(yǎng) 48h后,Ezrin蛋白表達(dá)降低,但與對照組比較,差異無顯著性(P＞0.05),而磷酸化Ezrin蛋白表達(dá)明顯降低,與對照組比較,差異有顯著性(t=3.430,P=0.006);10 μmol/L黃芩素干預(yù)后,Ezrin和磷酸化Ezrin蛋白表達(dá)的抑制作用明顯增強(qiáng),與對照組比較,差異均有顯著性(t=2.735,P=0.021;t=3.997,P=0.003),見圖4、表2。

圖4 Western blot檢測黃芩素對PANC-1細(xì)胞Ezrin和磷酸化Ezrin蛋白表達(dá)的影響

表2 黃芩素處理后Ezrin和磷酸化Ezrin蛋白相對含量比較(n=6)

表2 黃芩素處理后Ezrin和磷酸化Ezrin蛋白相對含量比較(n=6)

與對照組比較*P＜0.01;※P＜0.05。

組別 Ezrin Phos-Ezrin黃芩素處理組/μmol? L-1 5.0 0.75±0.180.45±0.10※10.0 0.55±0.19*0.35±0.10*對照組 0.88±0.150.67±0.16

2.3 RT-PCR檢測黃芩素對 PANC-1細(xì)胞 Ezrin mRNA表達(dá)的影響

5 μmol/L黃芩素培養(yǎng)48 h后,Ezrin mRNA表達(dá)即有抑制作用,但與對照組比較,差異無顯著性(t=2.169,P=0.055),而 10 μmol/L 黃 芩素對PANC-1細(xì)胞Ezrin mRNA表達(dá)的抑制作用明顯增強(qiáng),與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.423,P=0.000),見圖 5 、表 3。

2.4 黃芩素對PANC-1細(xì)胞爬行能力的影響

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測PANC-1細(xì)胞爬行能力(閉合寬度/原寬度,%),結(jié)果顯示:24 h后,對照組細(xì)胞形態(tài)較正常,呈長梭形及多角形,透亮,劃痕區(qū)域可見相當(dāng)數(shù)量的類梭形細(xì)胞生長,少數(shù)細(xì)胞呈圓型,不透亮,劃痕基本上達(dá)到愈合;黃芩素5 μmol/L處理組細(xì)胞生長緩慢,呈短梭形,劃痕區(qū)域有細(xì)胞爬行,殘留有劃痕存在,與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.951,P=0.000);黃芩素10 μmol/L處理組細(xì)胞部分死亡,殘存細(xì)胞呈短梭形,透亮,劃痕區(qū)域只有幾乎無細(xì)胞爬行,與對照組及 5 μmol/L處理組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=34.294,29.791;P=0.000,0.000),見表4。

圖5 RT-PCR檢測Ezrin mRNA在PANC-1細(xì)胞中的表達(dá)(PCR 產(chǎn)物大小:Ezrin450 bp、β-actin 550 bp)

表3 黃芩素處理后 Ezrin mRNA相對含量比較(,n=6)

表3 黃芩素處理后 Ezrin mRNA相對含量比較(,n=6)

*與對照組比較 P＜0.01。

組別 Ezrin mRNA黃芩素處理組/μmol?L-1 5.0 0.50±0.0910.0 0.30±0.09*對照組 0.63±0.12

表4 黃芩素對 PANC-1細(xì)胞爬行能力的影響(%,,n=8)

表4 黃芩素對 PANC-1細(xì)胞爬行能力的影響(%,,n=8)

*與對照組比較 P＜0.01,△與黃芩素 5μmol處理組比較 P＜0.01。

組別 劃痕時(shí)間/h 024黃芩素處理組/μmol?L-1 5.0 0.0±0.0 64.5±4.5﹡10.0 0.0±0.0 10.5±2.5﹡△對照組 0.0±0.0 88.0±10.3

2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)觀察黃芩素對PANC-1細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力的影響

黃芩素 10 μmol/L處理組 PANC-1細(xì)胞的遷移/侵襲能力均明顯下降,穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,與對照組及5 μmol/L處理組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.163/7.620,4.223/4.745;P=0.003/0.000,0.003/0.001),見表 5。

2.6 掃描電子顯微鏡下觀察黃芩素對PANC-1細(xì)胞偽足的形態(tài)和數(shù)量的影響

在2000倍視野下可見對照組細(xì)胞形態(tài)飽滿,有較多的片狀偽足和大量的線狀偽足,偽足比較伸展,而黃芩素10 μmol/L處理組細(xì)胞體積縮小,偽足變短且數(shù)量減少,與對照組及5 μmol/L處理組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.374,5.578;P=0.000,0.001),見表6。

表5 黃芩素對PANC-1細(xì)胞遷移/侵襲能力的影響(平均細(xì)胞數(shù)/視野,n=5)

表5 黃芩素對PANC-1細(xì)胞遷移/侵襲能力的影響(平均細(xì)胞數(shù)/視野,n=5)

*與對照組及黃芩素5μmol處理組比較 P＜0.01。

組別 穿膜細(xì)胞數(shù)無Matrige 包被Matrigel黃芩素處理組/μmol? L-1 5.0 192.6±36.8 158.0±34.910.0 103.6±29.4* 70.0±22.4*對照組 232.0±62.4 181.8±24.0

表6 黃芩素對PANC-1細(xì)胞偽足形成的影響(n=5)

表6 黃芩素對PANC-1細(xì)胞偽足形成的影響(n=5)

*與對照組及黃芩素5μmol/L處理組比較 P＜0.01。

組別 細(xì)胞偽足數(shù)黃芩素處理組/μmol? L-1 5.0 15.2±2.410.0 8.6±1.1*#對照組 18.0±2.2

3 討論

篩選有效的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物,對提高胰腺癌治療效果、改善其惡劣預(yù)后,無疑具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果顯示,黃芩素具有較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞惡性增殖作用,且呈明顯的時(shí)間和劑量依賴性。有研究[1]顯示,黃芩素還具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥作用,對化療藥物具有協(xié)同增效效應(yīng)。而絕大多數(shù)胰腺癌細(xì)胞對目前臨床應(yīng)用的化療藥物耐藥,提示黃芩素對抗胰腺癌治療具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

目前的研究[1-9]認(rèn)為,黃芩素抗腫瘤作用機(jī)制主要集中于以下幾個(gè)方面:①影響花生四烯酸系統(tǒng)代謝途徑?；ㄉ南┧崾嵌喾N生物活性物質(zhì)的前體,雖然在生理狀態(tài)下水平很低,但當(dāng)細(xì)胞膜受到各種刺激(如生長因子、化學(xué)因子等)或磷脂酶功能異常時(shí),細(xì)胞膜磷脂在磷脂酶A2和磷脂酶C的作用下分解釋放出游離的花生四烯酸?；ㄉ南┧嶂辽倏山?jīng)過三條代謝途徑,形成具有生物活性的二十碳衍生物,即細(xì)胞色素P-450途徑、環(huán)氧合酶途徑和脂氧酶途徑。脂氧酶家族成員大致分為四大類,即5-LOXs、血小板型12-LOXs、12/15-LOXs和表皮型 LOXs,其中,血小板型12-LOX將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為12-羥廿碳四烯酸(12-hydroxyeicosatetraenoicacid,12-HETE)。研究表明12-HETE是一種重要的信號(hào)分子,可通過 NF-κ B、ERK1/2、PKC 、PI3 k 和 SrcK 等多條信號(hào)傳導(dǎo)通路,參與對腫瘤細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲、血管生成和凋亡等的調(diào)節(jié)。大量研究證實(shí)黃芩素是選擇性12-LOX抑制劑,可通過抑制12-LOX表達(dá)和活性,抑制12-HETE的生成,從而發(fā)揮其抗腫瘤活性。②影響細(xì)胞周期多種調(diào)控因子的表達(dá)或活性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖周期停滯。③影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)或活性、激活線粒體死亡通路等,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。④抗腫瘤新生血管生成。黃芩素不僅可顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、芽突形成及形成血管樣結(jié)構(gòu),而且,還可抑制VEGF的表達(dá),抑制腫瘤血管生成。此外,黃芩素還具有抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。體外研究[5-9]顯示,用黃芩素處理的腫瘤細(xì)胞,絲狀突起明顯減少,細(xì)胞密度降低,黏附性、運(yùn)動(dòng)和遷移能力顯著降低。動(dòng)物試驗(yàn)[8-9]也顯示,原位注射種植用黃芩素處理的人高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞,可顯著減少腫瘤肺轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果亦顯示,黃芩素可顯著減少腫瘤細(xì)胞偽足,降低腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力。

在前面的研究中,我們發(fā)現(xiàn)膜-細(xì)胞骨架連接蛋白Ezrin在胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用,且下調(diào)其表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的惡性增殖及侵襲遷移能力。本研究結(jié)果顯示:以低于IC50劑量的小劑量黃芩素即可下調(diào)Ezrin mRNA和Ezrin蛋白表達(dá),且隨劑量增加而抑制作用顯著增強(qiáng)。提示下調(diào)Ezrin蛋白表達(dá)可能是黃芩素抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制之一。

研究[10-11]表明,通常情況下,Ezrin C端與N端能夠發(fā)生分子內(nèi)的相互作用,形成頭尾相連的折疊狀態(tài),或與ERM家族其他成員結(jié)合,從而以失活狀態(tài)存在于胞漿中,而Ezrin蛋白的磷酸化激活是Ezrin發(fā)揮其對細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)循環(huán)調(diào)控功能的必需條件。本研究結(jié)果還顯示:相比較而言,黃芩素對Ezrin蛋白的磷酸化抑制作用更強(qiáng),提示黃芩素還可通過抑制Ezrin蛋白的磷酸化而發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移作用。

本研究結(jié)果表明,黃芩素不僅具有較強(qiáng)的抑制胰腺癌細(xì)胞惡性增殖作用,而且還可抑制胰腺癌細(xì)胞膜-細(xì)胞骨架連接蛋白Ezrin的表達(dá)及其活化,可能具有抗胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的潛在應(yīng)用價(jià)值。而且,作為一種傳統(tǒng)中藥,黃芩素還具有毒、副作用小的特點(diǎn),價(jià)格低廉,藥源充足,很有開發(fā)前景。

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[責(zé)任編輯 姬 荷]

Effect and mechanism of baicalein on human pancreatic cancer PANC-1 cell proliferation and metastasis

REN Xue-qun1,LI Yi-xiong2*(1.Department of General Surgery,Huaihe Hospital,Henan University,Kaifeng,Henan 475000,China;2.Department of General Surgery,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China)

Objective:To investigate the effect and its probable mechanism of baicalein on human pancreatic cancer PANC-1 cell proliferation and metastasis.Methods:Human pancreatic cancer PANC-1 cells were cultured in vitro.Cell proliferation was detected by MTT method,cell pseudopodia was observed by scanning electron microscopy,the migration and invasion ability of cells were detected by wound healing assay and trans well assay,expressions of Ezrin and phosphate-Ezrin protein were detected by western blotting,and Ezrin mRNA was detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RTPCR)in PANC-1 cells treated by baicalein.Results:Baicalein suppressed PANC-1 cell proliferation in a time and dose dependent manner.Treated with baicalein,the number of pseudopodia per cells,the migration andinvasion ability of PANC-1 cells decreased significantly.Reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)and Western blotting results revealed that baicalein notably regulated down Ezrin expression at both mRNA and protein levels,and inhabited its phosphorylation as well.Conclusion:Baicalein can inhibit human pancreatic cancer PANC-1 cell proliferation,invasion and metastasis,which may be the results of down-regulation the expression level of Ezrin mRNA and Ezrin protein as well as its phosphorylation.

Ezrin;Pancreatic Adenocarcinoma;Baicalein

R735.9

A

1672-7606(2010)03-0180-06

2010-03-10

任學(xué)群(1964-),男,河南正陽人,博士,教授,主任醫(yī)師,從事肝膽胰外科方面的研究工作。

*通訊作者:李宜雄(1959-),男,湖南嘉禾人,教授,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,從事胰肝外科的臨床工作及相關(guān)基礎(chǔ)研究。