盧 紅

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院腫瘤科,河南 開封 475000)

Beta-微管蛋白ⅢASODN對Ec9706/P-1細(xì)胞凋亡的影響

盧 紅

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院腫瘤科,河南 開封 475000)

目的:觀察β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ,T UBB3)反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide,ASODN)對Ec9706/P-1細(xì)胞凋亡的影響。方法:以體外誘導(dǎo)的人食管癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株Ec9706/P-1為模型,設(shè)ASODN組和無關(guān)序列寡核苷酸(Nonsense oligonucleotide,NSODN)組,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測 NF-κ Bppabp65、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá);采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測NF-κ Bppabp65、bcl-2和 caspase-3mRNA的表達(dá);采用DNA凝膠電泳和吖啶橙熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果:免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示ASODN組NF-κ Bppabp65蛋白表達(dá)率與NSODN組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),ASODN組Bcl-2蛋白表達(dá)率與NSODN組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),ASODN組Caspase-3蛋白表達(dá)率與NSODN組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);RT-PCR法顯示 ASODN組caspase-3 mRNA條帶亮度強(qiáng)于NSODN組,bcl-2 mRNA條帶亮度低于NSODN組,ASODN組NF-κ Bppab mRNA條帶亮度與NSODN組相近;DNA凝膠電泳顯示紫杉醇作用后ASODN組有凋亡特征的DNA改變,而NSODN組細(xì)胞卻未出現(xiàn);吖啶橙熒光染色法表明ASODN組凋亡率與NSODN組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:T UBB3反義寡核苷酸增加了紫杉醇對Ec9706/P-1細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡能力,證明了Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)變化很可能是產(chǎn)生紫杉醇耐藥的主要機(jī)制之一。

β-微管蛋白Ⅲ;食管癌;耐藥;凋亡

食管癌在我國發(fā)病率較高,尤以河南省林州市為高發(fā)區(qū)之一,嚴(yán)重威脅著人民的生命健康。食管癌預(yù)后較差,紫杉醇是化療有效藥物之一,但其產(chǎn)生的獲得性耐藥使得許多患者失去了治療機(jī)會。我們已成功建立食管癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株Ec9706/P-1,并對其耐藥性進(jìn)行了鑒定[1],發(fā)現(xiàn)β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ,T UBB3)的高表達(dá)可能是其產(chǎn)生獲得性耐藥的主要原因之一[2]。為進(jìn)一步探討其他可能機(jī)制,我們擬采用β-微管蛋白Ⅲ反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide,ASODN)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),觀察Ec9706/P-1細(xì)胞凋亡及其相關(guān)蛋白的變化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)

人食管鱗癌細(xì)胞株EC 9706由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈,Ec9706/P-1由作者建立并保存[1],均培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為15%FCS胎牛血清、100 U/L青霉素和100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑

紫杉醇(Paclitaxel)購于四川太極制藥廠;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamin2000)購于 Invitrogen公司;SP-9000免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞凋亡-DNALadder抽提試劑盒(離心柱式)購于碧云天生物技術(shù)研究所;One-step RT-PCR試劑盒購于北京賽百盛公司;Caspase-3兔抗人多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;NFkappab-p65兔抗人多克隆抗體購于武漢博士得生物工程有限公司;Bcl-2鼠抗人多克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 寡核苷酸(Oligonucleotide,ODN)序列及合成

T UBB3 ASODN參照文獻(xiàn)[3]的方法,由北京賽百盛公司合成,全程硫代修飾,序列為:5′-ACGTGGGCGACTCGG-3′,并設(shè)計與其堿基組成相同,但堿基順序隨機(jī)排列的無義寡核昔酸序列(nonsense oligodeoxynucleotides,NSODN)作為對照,由北京賽百盛公司合成,全程硫代修飾,其序列為:5′-GGCGACGTGCGTCGA-3′。在Genbank中行證實(shí)ASODN僅與T UBB3基因相應(yīng)位點(diǎn)匹配,NSODN與任何已知哺乳動物基因無匹配。

1.4 細(xì)胞分組及預(yù)處理

分為ASODN組和NSODN組:取對數(shù)生長期細(xì)胞,細(xì)胞貼壁至50%～60%,體積分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶消化,反復(fù)吹打后收集細(xì)胞,PBS液洗滌1次,于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中過夜,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,并用無血清無雙抗的 RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞 1次,將形成 ASODN-LF2000和NSODNLF2000的濃度為1.0 μmol/L的復(fù)合物加入相應(yīng)細(xì)胞中,輕輕混勻,37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h,棄去轉(zhuǎn)染液,加入完全1640培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)20 h,各組細(xì)胞以紫杉醇終濃度1.0mg/L作用8 h,開始實(shí)驗(yàn)。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測Ec9706/P-1細(xì)胞Bcl-2蛋白、Caspase-3蛋白和NF-κ Bppabp65蛋白的表達(dá)

細(xì)胞常規(guī)胰酶消化,接種于經(jīng)預(yù)處理的蓋玻片上,待其長滿后用-20℃體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定5min,按照說明書進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。光鏡每高倍視野下(×400)隨機(jī)觀察100個細(xì)胞,以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞,計算細(xì)胞陽性率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計算各次陽性率的均值。

1.6 半定量 RT-PCR法檢測NF-κ Bppab mRNA、caspase-3 mRNA和bcl-2 mRNA的表達(dá)

bcl-2引物采用Primer Premier5軟件設(shè)計,caspase-3引物參照文亞淵等[4]設(shè)計,NF-κ Bppab引物參照董為紅等[5]設(shè)計,由北京賽百盛公司合成,-20℃保存?zhèn)溆?。各引物序列?β-actin:上游 5′-CATCCTGCGTCTGACCT-3′,下游 5′-TCAGGAGGAGCAATGATCT TG-3′(長度:480bp);caspase-3:上游 5′-ATGGACAACAACGAAACCTCCGTG-3′,下游 5′-CCACTCCCAGTCATTCCTTTAGTG-3′(長度:857bp);bcl-2:上游 5′-AGACAGCCAGGAGAAATCAAACAG-3′,下游 5′-TCCACCTGACGCCCT TCAC-3′(長度 :293bp);NF-κ Bppab:上游 5′-TCATCTTCCCGGCAGAGCCAG-3′,下游:5′-GTGGGTCTTGGTGGTATCTGT-3′(長度:136bp)。收集各組細(xì)胞,分別抽提總RNA,參照一步法RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:第一條cDNA鏈合成,45℃,30min;預(yù)變性,94℃預(yù)變性2min,然后94℃變性30 s,bcl-2退火溫度55℃下退火30 s,caspase-357.5 ℃退火30 s,NF-κ Bppab 52℃退火60 s;72℃延伸1min。上述3步驟進(jìn)行30個循環(huán)后,再72℃繼續(xù)延伸5min,置4℃保存。

1.7 DNA凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡

按照說明書進(jìn)行操作,取部分抽提得到DNA,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。陽性結(jié)果判定:細(xì)胞DNA凝膠電泳后在紫外燈下出現(xiàn)階梯狀(Ladder)條帶。

1.8 吖啶橙熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡變化

收集細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液1×104/mL,PBS洗2遍。吸取95 μ L細(xì)胞懸液滴于潔凈玻片上,5 μ L吖啶橙混勻,蓋玻片封閉,立即置于熒光顯微鏡下觀察拍照。熒光顯微鏡每高倍視野下(×400)隨機(jī)觀察100個細(xì)胞,以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的黃綠色染色,甚至可見黃綠色碎片為陽性細(xì)胞,計算細(xì)胞陽性率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計算凋亡率,凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/100×100%。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);計量資料采用成組設(shè)計資料兩樣本均數(shù)比較的 t檢驗(yàn),以表示。以 α=0.05作為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測Ec9706/P-1細(xì)胞Bcl-2蛋白、Caspase-3蛋白和NF-κ Bppabp65蛋白的表達(dá)

Bcl-2 蛋白、Caspase-3 蛋白和 NF-κ Bppabp65 蛋白在Ec9706/P-1細(xì)胞中表達(dá)于細(xì)胞漿,呈棕黃色顆粒,見圖 1、2、3。ASODN 組 NF-κ Bppabp65 蛋白表達(dá)率為(66.72±4.43)%,NSODN組 NF-κ Bppabp65蛋白表達(dá)率為(68.20±5.73)%,二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.354,P＞0.05);ASODN組Bcl-2蛋白表達(dá)率為(32.52±5.57)%,NSODN組Bcl-2蛋白表達(dá)率為(48.27±6.31)%,二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.241,P＜0.05);ASODN組Caspase-3蛋白表達(dá)率為(61.23±9.64)%,NSODN組Caspase-3蛋白表達(dá)率為(40.01±7.67)%,二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.984,P＜0.05)。

圖1 Ec9706/P-1細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)(SP×200)

圖2 Ec9706/P-1細(xì)胞NF-κ Bppabp65蛋白的表達(dá)(SP×200)

圖3 Ec9706/P-1細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)(SP×200)

2.2 半定量RT-PCR法檢測caspase-3 mRNA、bcl-2 mRNA 和NF-κ Bppab mRNA 的表達(dá)

ASODN組caspase-3 mRNA條帶亮度強(qiáng)于NSODN組,而bcl-2 mRNA條帶亮度低于NSODN組,ASODN 組 NF-κ Bppab mRNA 條帶亮度與NSODN組相近,見圖4;ASODN組caspase-3 mRNA相對表達(dá)量為0.77±0.13,NSODN組caspase-3 mRNA相對表達(dá)量為0.47±0.11,二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.332,P＜0.05);ASODN組bcl-2 mRNA相對表達(dá)量為0.40±0.09,NSODN組bcl-2 mRNA相對表達(dá)量為0.72±0.10,二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.12,P＜0.05);ASODN組 NF-κ Bppab mRNA相對表達(dá)量為0.67±0.15,NSODN組NF-κ Bppab mRNA 相對表達(dá)量為0.70±0.18,二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.547,P＞0.05)。

2.3 DNA凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡

紫杉醇作用后ASODN組有凋亡特征的DNA改變,即形成典型的 DNA降解“梯狀”條帶片段(DNA Ladder),而NSODN組細(xì)胞卻未出現(xiàn),見圖5。

圖4 RT-PCR法檢測Ec9706/P-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

圖5 Ec9706/P-1細(xì)胞凋亡DNA ladder

2.4 吖啶橙熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡

紫杉醇作用后ASODN組細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的黃綠色染色,甚至可見黃綠色碎片,凋亡率為(0.69±0.15)%,而NSODN組細(xì)胞大部分細(xì)胞核DNA為黃色或黃綠色均勻熒光,細(xì)胞質(zhì)和核仁RNA為桔黃色或桔紅色熒光,見圖 6,凋亡率為(0.08±0.02)%,二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.982,P＜0.05)。

圖6 Ec9706/P-1細(xì)胞凋亡形態(tài)(AO×400)

3 討論

本研究表明:轉(zhuǎn)染 TUBB3 ASODN后,在紫杉醇的誘導(dǎo)下,呈現(xiàn)出不同的凋亡現(xiàn)象。有報道證明,微管蛋白數(shù)量的減少降低了微管蛋白的聚合能力,這是因?yàn)槲⒐艿鞍椎臐舛仁俏⒐芫酆系谋匾獥l件[6]。有文獻(xiàn)[7]顯示,當(dāng)微管蛋白減少60%～70%時,細(xì)胞的生存嚴(yán)重受到了威脅。

ASODN組吖啶橙染色后,在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)致密濃染的黃綠色染色,甚至可見黃綠色碎片熒光,凋亡特征的DNA改變,而其余各組變化不明顯,這說明隨著T UBB3的減少,細(xì)胞發(fā)生的凋亡就越明顯。由此推斷出凋亡途徑可能發(fā)生了改變。本研究發(fā)現(xiàn)ASODN組抗凋亡因子Bcl-2在蛋白水平和RNA水平表達(dá)降低,NFkB表達(dá)變化不明顯,而促凋亡因子Caspase-3表達(dá)升高。

微管蛋白通過秋水仙堿、長春堿、埃坡霉素、紫杉醇等調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期和凋亡有關(guān)的基因和蛋白激酶的表達(dá)[8-9],諸如Bcl-2,Cdc25c,蛋白激酶A,c-Jun和NFκ B[10-11]。作者認(rèn)為,有幾種機(jī)制存在:①TUBB3轉(zhuǎn)染后,微管蛋白系統(tǒng)恢復(fù)了原有的結(jié)構(gòu),也就暴露出了紫杉醇的結(jié)合位點(diǎn),紫杉醇得以作用于細(xì)胞的有絲分裂期M期,使部分細(xì)胞阻滯于G2-M期,中斷了細(xì)胞周期,通過各種信號途徑(包括死亡信號),Bcl-2癌蛋白磷酸化從而使 Bcl-2蛋白失活,誘導(dǎo)凋亡[12-13],同時,由于 Bcl-2蛋白失活導(dǎo)致最終的Caspase-3活化上調(diào),共同完成了凋亡途徑。所以,盡管抗微管藥物所誘導(dǎo)的凋亡機(jī)制還不十分明了,但是Bcl-2家族在凋亡途徑中占有重要地位[14-16]。②普遍認(rèn)為抗有絲分裂藥物誘導(dǎo)凋亡的主要機(jī)制之一是:有絲分裂受到干擾,導(dǎo)致 Bcl-2的磷酸化,使Bax、Bak、Bid以及其他Bcl-2家族成員中的促凋亡因子得到釋放,從而導(dǎo)致凋亡。然而有人[17-18]認(rèn)為有絲分裂的阻滯并不是抗有絲分裂藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要因素。研究[19]發(fā)現(xiàn),在缺乏細(xì)胞質(zhì)的情況下,微管獨(dú)立于線粒體與秋水仙堿和紫杉醇的藥物結(jié)合的位點(diǎn)而存在這一事實(shí)說明,在線粒體膜內(nèi)外直接作用于微管蛋白可能是干擾微管蛋白功能的又一特點(diǎn)。微管蛋白二聚體的結(jié)構(gòu)改變或其內(nèi)部由于結(jié)合導(dǎo)致的Bcl-2配體的變化可能調(diào)節(jié)了Bcl-2及其家族成員和其他凋亡相關(guān)蛋白的功能。有研究[20]顯示紫杉醇在治療上皮性腫瘤時,可以改變Bax/Bcl-2的比例。因此,可以理解為,TUBB3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染Ec9706/P-1細(xì)胞后,紫杉醇得以與細(xì)胞的微管位點(diǎn)結(jié)合,從而改變了后者的Bcl-2配體的結(jié)構(gòu),使得與之結(jié)合更緊密,而促凋亡因子得以釋放,從而顯現(xiàn)出明顯的凋亡現(xiàn)象。以上兩點(diǎn)提示 TUBB3反義寡核苷酸并不是直接改變了Bcl-2和Caspase-3的表達(dá),但是可能間接通過紫杉醇的作用影響了二者的表達(dá)和活性,從而了啟動了凋亡效應(yīng),出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象。③NF-κ B在凋亡中的作用不容忽視,然而關(guān)于NF-κ B在凋亡中的作用卻有不同報道。有研究[21]稱紫杉醇及其他抗微管藥物通過激活NF-κ B/Iκ B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是使細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。④體外實(shí)驗(yàn)表明在化療藥物5-氟脲嘧啶(5-FU)、阿霉素、紫杉醇和順鉑的作用下,NFkB被激活上調(diào)[22]從而削弱化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力[23]。已有結(jié)果[23-24]顯示,NFkB能夠抑制細(xì)胞對紫杉醇和順鉑的敏感性。而本研究中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染后NF-kB表達(dá)水平無明顯變化?？赡苡捎谧仙即嫉靡耘c細(xì)胞的微管蛋白結(jié)合,紫杉醇作用后,盡管不影響NF-kB的表達(dá),但是下調(diào)Iκ Bα,反過來啟動NF-κ B的核定位,激活了凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,轉(zhuǎn)染起了間接作用使得NF-kB誘導(dǎo)凋亡。但是這仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

由此可見,TUBB3反義寡核苷酸增加了紫杉醇對Ec9706/P-1細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡能力,凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和 Caspase-3表達(dá)分別降低和升高,而 NF-κ Bp65沒有變化。提示T UBB3可能間接影響了Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)和活性。食管癌對紫杉醇產(chǎn)生耐藥的機(jī)制及其復(fù)雜,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 TUBB3 ASODN后,凋亡相關(guān)蛋白及凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)了不同的變化,這就啟發(fā)我們思考在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,一些相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子是否發(fā)生了變化,發(fā)生了哪些變化,我們將進(jìn)行更深一步的研究。

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[責(zé)任編輯 姬 荷]

Effect ofβ-tubulin Ⅲ antisense oligonucleotides on Ec9706/P-1 cells apoptosis

LU Hong(Department of Oncology,Huaihe hospital of Henan University,K ai feng,Henan 475000,China)

Objective:To investigate the effect ofβ-tubulin Ⅲ antisense oligonucleotides on Ec9706/P-1 cells apoptosis,study the expression of NF-κ Bppabp65、Bcl-2 and Caspase-3,and to investigate the possible mechanism of acquired resistance of Paclitaxel-resistant human esophageal carcinoma cell line Ec9706/P-1.Methods:There were 2 groups in this study:antisense oligonucleo tides(ASODN)group and oligodeoxynucleotides(NSODN)group.Immunohistochemistry assay was performed to detect the expression of Bcl-2 protein,caspase-3 protein and NF-κ Bppab protein in Ec9706/P-1 cells.The expression level of Bcl-2 mRNA,caspase-3 mRNA and NF-κ BppabmRNA were detected by semi-quantity RT-PCR assay.DNA fragments were resolved by agarose gel electrophoresis to detect cell apoptosis.Apoptosis rates and morphology were detected by arcading orange(AO)staining.Results:The expression rate of Bcl-2 protein in ASODN group was lower than that in NSODN group statistically(P＜0.05).The expression rate of caspase-3 protein in ASODN group was higher than that in NSODN group statistically(P ＜0.05).There was no significant difference in the expression of NF-κ Bppab protein between ASODN group and NSODN group(P＞0.05).The expression level of Bcl-2 mRNA in ASODN group was lower than that in NSODN group statistically(P＜0.05).The expression level of caspase-3 mRNA in ASODN group decreased significantly compared with that of NSODN group(P＜0.05).There was no significant difference in the expression of NF-κ Bppab mRNA between ASODN group and NSODN group(P＞0.05).There was obvious apoptosis characteristic DNA ladder in ASODN group induced by Paclitaxel but not in NSODN group.The apoptosis rate in NSODN group was lower significantly than that in ASODN group(P＜0.05).Conclusion:TUBB3 ASODN increases the apoptosis of Ec9706/P-1 cells induced by Paclitaxel.It is proved that Bcl-2 and caspase-3 may be one of the main mechanisms of acquired resistance of Paclitaxel-resistant human esophageal carcinoma cell line Ec9706/P-1.

β-TubulinⅢ Esophageal;Carcinoma;Drug-resistance;Apoptosis

R735.1

A

1672-7606(2010)03-0164-06

2010-05-10

盧紅(1973-),女,河南 開封 人,博士,主治醫(yī)師,副教授,從事惡性腫瘤綜合治療的工作。