鄭 紅,林 波,趙國強,董子明*

(1.河南大學醫(yī)學院病理生理教研室,河南 開封 475004;2.鄭州大學基礎醫(yī)學院,河南 鄭州 450052)

慢病毒載體的構建及低表達和過表達CEA EC9706細胞株的建立

鄭 紅1,林 波1,趙國強2,董子明2*

(1.河南大學醫(yī)學院病理生理教研室,河南 開封 475004;2.鄭州大學基礎醫(yī)學院,河南 鄭州 450052)

目的:構建人癌胚抗原(CEA)慢病毒siRNA和表達載體并包裝成感染性病毒顆粒,獲得穩(wěn)定低表達和過表達CEA的EC9706細胞。方法:構建CEA siRNA載體:依據(jù)siRNA靶序列設計原則,針對人CEA的cDNA序列,設計并合成編碼siRNA的3對寡核苷酸序列,克隆入siRNA載體(pRNA T-U6.2/Lenti)中構建3個重組體pRNAT-U6.2-SCEA。構建CEA表達載體:以人CEA的測序質粒為模板,PCR擴增CEA全長,裝入pLentiGFP轉移質粒,經過測序證實其序列與標準序列完全一致。然后進行重組慢病毒分別感染EC9706細胞,G418篩選得到穩(wěn)定感染細胞株。分別用熒光定量Real-time RT-PCR和Western blot檢測EC9706細胞中CEA基因表達抑制或增強的效果。結果:EC9706病毒感染48 h后熒光顯微鏡觀察CEA慢病毒載體在細胞中高效表達,經過 RTPCR和Western-blot驗證:得到3株穩(wěn)定CEA低表達的EC9706細胞株,其中一個CEA的表達幾乎得到完全抑制,1株穩(wěn)定CEA過表達的EC9706細胞株(EC9706-CEA)。結論:建立了穩(wěn)定低表達和過表達CEA的EC9706細胞株,成功調控食管癌EC9706細胞中CEA的表達,為進一步從分子水平探討CEA的功能奠定了基礎。

癌胚抗原;EC9706;慢病毒載體

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)屬于非器官特異性腫瘤相關抗原,它不僅作為一種單純的腫瘤標志物存在,而且是與腫瘤惡性化有關的一種復雜的分子。但目前對于CEA分子水平的研究主要集中在腫瘤治療前、治療中、治療后CEA表達的變化及其與腫瘤診斷、治療、預后的關系[1-3]。CEA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移有無內在聯(lián)系,對治療過程有什么影響,文獻中未見深入報道。本研究利用RNA干擾和基因重組技術,構建CEA siRNA慢病毒載體,同時構建CEA慢病毒表達載體,感染EC9706細胞,通過篩選得到低表達和過表達 CEA EC9706細胞株。旨在實現(xiàn)對CEA表達的調控,為進一步從分子水平探討CEA功能及對治療的影響打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

慢病毒包裝細胞株293FT購自美國Invitrogen公司;pCMV-SPORT6-CEA質粒購于proteintech公司;pGEM-T Easy克隆質粒購于Promega公司;pLentiGFP慢病毒表達載體和輔助包裝質粒 p△8.2、pVSV-G均由美國NIH職慧軍博士惠贈;pRNAT-U6.2/Lenti siRNA表達載體購于GenScript公司;鼠抗人CEA單克隆抗體、鼠抗人β-actin多克隆抗體及酶標抗鼠IgG(辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IgG抗體)為美國Santa Cruz公司產品。

1.2 方法

1.2.1 構建針對CEA基因的siRNA慢病毒載體設計靶向 CEA基因的寡核苷酸:利用 Takara和promega siRNA靶序列分析設計系統(tǒng),掃描人CEA cDNA編碼序列(NM_004363),根據(jù)siRNA靶序列設計原則,CEA基因siRNA靶序列最終確定為3個,分別是 341-359、1155-1173和 1281-1298。分別合成3對shDNA單鏈,兩端加上BamHI和XhoI內切酶殘基,由上海博尚生物公司合成。發(fā)卡DNA復性,純化;酶切并回收雙粘線性化pRNAT-U6.2/Lenti質粒;退火產物(雙鏈發(fā)卡DNA),與雙粘線性化siRNA表達載體 pRNAT-U6.2/Lenti連接;轉化,轉板;PCR初步篩選,陽性克隆測序鑒定。

1.2.2 構建表達CEA基因的慢病毒載體 引物設計、合成:參考GenBank的CEA基因序列設計出1對CEA全基因擴增引物,引物序列如下:上游,5′ACTCGAGATGGAGTCTCCCTCGGCCCCTCCC 3′;下游 ,5′CAAGCTTCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGCAC 3′。重組慢病毒載體轉移質粒pLentiGFP-CEA的構建、鑒定和測序:分別用 XhoL和HindⅢ雙酶切pGEM-T-CEA和慢病毒載體pLentiGFP后,膠回收得到雙粘片段和雙粘線形載體pLentiGF;將雙粘CEA片段與羥化后的雙粘線形載體pLentiGFP連接得重組載體pLentiGFP-CEA;以CEA全基因引物PCR擴增,鑒定是否插入目的基因;提取質粒送測序。

1.2.3 重組慢病毒包裝 制備重組體質粒(pRNAT-U6.2/Lenti-sC341、pRNAT-U6.2/Lenti-sC-1155、pRNAT-U6.2/Lenti-sC1281及 pLentiGFP-CEA)及空載體質粒,純化產物經紫外光柵分光儀測定各質粒濃度。分別與包裝質粒p△8.2、pVSV-G共轉染293ET細胞;收集病毒上清,純化后測定其病毒滴度。

1.2.4 過表達和低表達CEA EC9706細胞株的建立 復蘇培養(yǎng)EC9706細胞,待細胞處于對數(shù)生長期時,分組分別加入包裝的慢病毒,相當于每個細胞10個病毒的感染量。感染48 h后免疫熒光顯微鏡下觀察細胞內熒光情況。G418篩選后,建立穩(wěn)定表達的細胞株。

1.2.5 RT-PCR擴增鑒定 收集各組重組慢病毒感染和對照未感染的EC9706,提取RNA,逆轉錄得到cDNA,采用嵌合熒光檢測法,根據(jù)Real time PCR試劑盒(TaKaRa公司)與擴增儀(ABI5700型)說明,配制熒光定量PCR反應體系,以CEA全基因引物進行PCR擴增。以CEA基因拷貝數(shù)與β-actin基因拷貝數(shù)比值計算其相對表達量。

1.2.6 Western-blot檢測CEA表達 分別收集各組EC9706細胞,離心沉淀后作勻漿及超聲破碎處理,并使蛋白變性;SDS-PAGE凝膠電泳樣品,當藍色條帶消失時半干法轉移凝膠至硝酸纖維素膜(NC),封閉硝酸纖維素膜;加入人CEA單克隆抗體,4℃過夜;加入酶標二抗,慢搖2 h,顯影,定影;用βactin作內參照驗證蛋白的含量。

2 結果

2.1 CEA mRNA表達檢測結果

熒光定量RT-PCR檢測,各組細胞CEA mRNA表達水平,結果及比較見表1、圖1。EC9706-sCEA341、EC9706-sCEA1155和 EC9706-sCEA12813組細胞CEA mRNA表達都受到抑制,其中EC9706-sCEA1281組細胞的抑制效果最強。EC9706-CEA組細胞CEA mRNA表達明顯增強,而2個對照組(EC9706-siCon和 EC9706-Con)細胞中都存在較高水平的CEA mRNA表達,與空白對照組細胞對比CEA mRNA無顯著差異。

實驗組1～3:感染pRNAT-U6.2/Lenti-sC341、pRNAT-U6.2/Lenti-sC1155和pRNAT-U6.2/Lenti-sC1281包裝產生的慢病毒顆粒,經過G418篩選得到了3株穩(wěn)定轉染不同靶區(qū)段沉默CEA表達的EC9706細胞株,分別命名為 EC9706-sCEA341、EC9706-sCEA1155、EC9706-sCEA1281。實驗組 4:pRNAT-U6.2/Leni空載體包裝產生的慢病毒顆粒感染并篩選得到的EC9706細胞株,命名為EC9706-siCon。實驗組5:pLentiGFP-CEA包裝產生的慢病毒顆粒感染,并篩選得到的EC9706細胞株,命名為EC9706-CEA。實驗組6:pLentiGFP空載體包裝產生的慢病毒顆粒感染并篩選得到的EC9706細胞株,命名為EC9706-Con?？瞻讓φ战M:未轉染的正常食管癌EC9706細胞。

表1 各組中CEA mRNA的相對含量(n=6)

表1 各組中CEA mRNA的相對含量(n=6)

注:P為各組與空白對照組比較。

實驗1組 0.06±0.01 ＜0.01實驗2組 0.12±0.02 ＜0.01實驗3組 0.05±0.01 ＞0.05實驗4組 0.17±0.01 ＞0.05實驗5組 0.35±0.01 ＜0.01實驗6組 0.19±0.01 ＞0.05對照組 0.18±0.02

圖1 慢病毒感染細胞CEAmRNA相對表達量比較

圖2 各組細胞CEA Western blot結果

2.2 CEA免疫印跡(Western blot)結果

6個實驗組(EC9706-sCEA341、EC9706-sCEA1155、EC9706-sCEA1281、EC9706-siCon 、EC9706-CEA 和EC9706-Con)和未感染組(EC9706)CEA蛋白印跡結果見圖2。EC9706-sCEA341、EC9706-sCEA1155和EC9706-sCEA1281細胞中CEA蛋白均顯示抑制,其中EC9706-sCEA1281組細胞的抑制效果最強,EC9706-siCon和EC9706-Con CEA細胞中都存在較高水平的CEA蛋白表達,與未感染組(EC9706)對比CEA蛋白無顯著差異,而EC9706-CEA組細胞CEA蛋白與未感染組(EC9706)對比明顯增高。所有印跡出現(xiàn)位置約為180kDa處,與人CEA蛋白分子量一致。

3 討論

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默技術,又稱轉錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)[4]。RNAi技術近年來發(fā)展迅速,已成為分子生物學研究的主要技術手段之一,在功能基因組研究、信號轉導研究及基因治療方面顯示出巨大的前景。實驗結果表明根據(jù)CEA基因序列設計的短發(fā)卡狀寡核苷酸序列能特異性快速有效地封閉CEA基因的表達。實驗中設計的3個靶向siRNA寡核苷酸所達到抑制CEA表達的作用有差異,是因為依據(jù)siRNA設計原則常選擇起始密碼子下游第50～100個堿基以后一段cDNA序列作為靶點,研究[5]證明針對同一基因不同位置的cDNA序列所設計的siRNA對于該基因的抑制效應有著很大差別。本實驗也證實了這一點,sC341、sC1281對EC9706細胞CEA均有很好的抑制作用,sC1155則抑制CEA基因的效果不好,與前兩個序列有顯著差異。

基因工程的最終目的是將外源基因轉移到宿主細胞中高效穩(wěn)定表達。本研究所采用的慢病毒載體是近年來出現(xiàn)的一種新的基因轉移工具,多種研究[6-8]證實它可以在分裂和非分裂哺乳動物細胞中進行穩(wěn)定的高水平基因表達,感染效率高,表達穩(wěn)定,自身抗原性弱,可操控性強。目前,慢病毒載體經過不斷改造優(yōu)化,在生物安全性、病毒滴度及靶細胞嗜性范圍方面均有提高,能夠提供高效的基因轉移和長期穩(wěn)定的蛋白表達。本實驗中慢病毒載體采用三質粒系統(tǒng)進行構建,包括轉移質粒、包裝質粒和包膜蛋白質粒,其中轉移質粒中含有包裝、逆轉錄及整合所需的順式序列,保留多克隆位點,在其中插入目的基因CEA;包裝質粒在CMV啟動子的控制下,表達病毒復制所需的全部反式激活蛋白,但不產生病毒包膜蛋白及輔助蛋白VPU;包膜蛋白質粒編碼水皰性口炎病毒-G糖蛋白(VSV-G),應用VSV-G包膜的假構型慢病毒載體一方面降低病毒自我復制能力,提高生物安全性,另一方面拓寬與靶細胞的親合力,增加了載體的穩(wěn)定性,能夠允許通過高速離心對其進行濃縮,提高病毒滴度和活性,使真核轉染成功率大為提高。實驗中選用來源于人胚腎細胞系的293T包裝細胞完成對慢病毒載體三質粒系統(tǒng)的包裝,使其在包裝過程中能反式提供產生病毒顆粒所需的蛋白,并且由于引入VSV-G包膜的假構型載體,極大地提高了細胞親合性和穩(wěn)定性。

本實驗構建了CEA siRNA和表達慢病毒載體并成功地感染 EC9706細胞,經 RT-PCR擴增和Western Blot方法從mRNA和蛋白質水平檢測均表明獲得了穩(wěn)定低表達和過表達CEA EC9706細胞株,實現(xiàn)了對EC9706細胞中CEA表達水平的調控,為進一步探討CEA的作用機制奠定了基礎。

[1]Suouchi K,Machinami R,Mori M,et al.Clinical impact of carcinoembryonic antigen messenger ribonucleic acid expression in tumor-draining vein blood on postoperative liver metastasis in patients with colorectal carcinoma:A prospective,cohort study[J].Dis Colon Rectum,2003,46(4):467-473.

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[責任編輯 姬 荷]

Construction of lentiviral vector and establishment of stable EC9706 cell lines with lower or higher CEA expression

ZHENG Hong1,LIN Bo1,ZHAO Guo-qiang2,DONG Zi-ming2*(1.Department of Pathophysiology,Medical College of Henan University,K aifeng,Henan 475004,China;2.School of Basic Medical Science,Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,China)

Objective:To construct CEA siRNA vector and CEA expression vector,to package lentivirus particles,and to establish stable EC9706 cell lines with lower or higher CEA expression.Methods:Construction of CEA siRNA expression vector:according to the principle of designing siRNA sequence,aimed at human CEA cDNA sequence,three DNA oligonucleotides of short hairpin RNA sequence were synthesized,three hairpin DNAs were cloned into siRNA expression vector(pRNAT-U6.2/Lenti).Construction of CEA expression vector:CEA gene sequence was amplified as target gene from plasmid which contains CEA gene by PCR,ligated with lentiviral vector plasmid pLentiGFP and verified by sequencing.And then recombinated lentivirus were produced:the esophageal carcinoma EC9706 cell lines were infected respectively by lentivirus particles,the infected stable cell lines were established by G418 screening.The silencing and reinforcing expression of CEA was detected by real time RT-PCR and Western blotting.Results:The recombinant lentivirus high expression in EC9706 cells was observed through fluorescence microscope after 48h infection,verificated by real-time RT-PCR and Western-blot:Three stable EC9706 cell lines with lower CEA expression were established,among them,one was the best,its CEA expression was about completely depressed.Meanwhile EC9706 cell line with CEA overexpression was also established.Conclusion:Stable EC9706 cell lines with lower or higher CEA expression are established,CEA expression in EC9706 cells are successfully regulated.This facilitates further functional studies of CEA atmolecular level.

CEA;EC9706;Lentiviral vector

R73.3

A

1672-7606(2010)03-0160-04

2010-06-20

教育部科技創(chuàng)新工程重點項目(207150)

鄭紅(1970-),女,河南 開封 人,博士,副教授,從事腫瘤的發(fā)病機制及生物治療的研究。

*通訊作者:董子明(1953-),男,河南寶豐人,教授,博士生導師,從事分子腫瘤學研究。