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(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院,武漢 430030;2美國俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心)

心臟缺血性疾病的發(fā)病率和致死率在世界范圍內(nèi)呈增長趨勢(shì)[1]。心肌缺血再灌注(I/R)動(dòng)物模型的成功建立為缺血性心臟病治療提供必需的實(shí)驗(yàn)方法[2],其模型復(fù)制方法目前有兩種:無呼吸機(jī)支持胸腔外結(jié)扎和呼吸機(jī)支持改進(jìn)的心臟原位結(jié)扎法[3,4]。2008年 12月～2009年 12月,本研究結(jié)合使用小鼠呼吸機(jī),對(duì)心肌 I/R模型的手術(shù)技巧和注意事項(xiàng)進(jìn)行簡述,以期熟練掌握手術(shù)方式,快速準(zhǔn)確地建立高存活率動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型 C57BL/6雄性小鼠購買于Jackson實(shí)驗(yàn)室 (美國緬因州 Bar Harbor),共 30只,其中 20只用于建立 I/R模型(實(shí)驗(yàn)組),10只為假手術(shù)組。所有的實(shí)驗(yàn)操作獲得美國俄亥俄州立大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用機(jī)構(gòu)的許可,并且符合美國國立衛(wèi)生研究院相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和保護(hù)指導(dǎo)(NIH 85-23,1996)。

1.2 主要試劑及儀器 氯化三苯四氮唑(TTC,美國 Sigma公司)。藥品有氯胺酮、阿托品、甲苯噻嗪和異氟烷。小鼠通氣量呼吸機(jī),心電圖監(jiān)測(cè)儀,3-0和 7-0絲線,顯微外科手術(shù)器械,小動(dòng)物體溫監(jiān)測(cè)器,紅外線加熱器,心臟切片器,麻醉機(jī),激光多普勒灌注檢測(cè)儀。MetaVue Version 6.2r6分析軟件,高分辨率解剖顯微鏡(Nikon,SMZ1000)。伊文思藍(lán)(Evans Blue,美國 Sigma-Aldrich公司)。

1.3 動(dòng)物模型的改進(jìn) 參考文獻(xiàn)[4,5]的方法并加以改進(jìn)。具體方法如下:小鼠用氯胺酮(50 mg/kg)合并使用肌松劑甲苯噻嗪(15mg/kg)麻醉。為控制呼吸道分泌物,術(shù)前給予阿托品。待小鼠麻醉后,采用 PE-90號(hào)插管做氣管插管,采用內(nèi)外芯結(jié)構(gòu),將插管套在內(nèi)芯為 20 G鈍性鋼針外。肉眼直視觀察到氣管插管針進(jìn)入氣管后緩慢推動(dòng)至器官分叉上方,拔出內(nèi)芯,與小鼠呼吸機(jī)連接。調(diào)節(jié)小鼠潮氣量維持在 250～300 ml/min,控制呼吸頻率在 110～130次/m in。采用紅外線體溫加熱器維持體溫在36.5～37℃。開胸手術(shù):小鼠采用右側(cè)臥位,暴露左側(cè)腋窩,從左腋窩下緣做橫行切口至左胸骨旁剪開皮膚,距離胸骨中線約 2mm,整個(gè)橫行切口大約8mm,皮下血管電凝結(jié)扎止血。逐層分離,剪斷胸大小肌,適當(dāng)電凝止血。暴露胸壁肋間隙,在第 4或第 5肋間隙鈍性分離肋間肌,進(jìn)入胸腔。采用自制拉鉤,以四角撐開肋間隙暴露范圍 6～8 mm,可根據(jù)手術(shù)需要適當(dāng)調(diào)整大小。剝離心包膜充分顯露左心耳及左心室。在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間,找到行于心肌內(nèi)與心大靜脈走向一致的冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD),以 7-0無損傷縫針距離左心耳下緣 2mm左右穿過心肌表層,在肺動(dòng)脈圓錐旁出針。待穩(wěn)定 15 min后,在心臟表面結(jié)扎處放一長約 2mm,大小為10號(hào)的聚乙烯管,在其上作一活結(jié)以結(jié)扎 LAD,心電圖顯示 ST段弓背向上抬高,心臟表面相應(yīng)區(qū)域原色變?yōu)樯n白表明缺血成功;在 30 min缺血后,PE管被移出,LAD重新開放,心臟表面由蒼白變?yōu)轷r紅表明心肌組織恢復(fù)再灌注。再灌注時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可設(shè)置不同時(shí)間點(diǎn);再灌注開始后,縫合肋骨,逐層縫合肌肉和皮膚。剪斷門齒掛線,松開四肢及尾部固定。待小鼠蘇醒四肢有力時(shí),方可拔出氣管插管。根據(jù) TTC染色需要,我們?cè)谠俟嘧⒑?24m in處死小鼠。假手術(shù)組開胸后,僅將縫針穿過 LAD,但不做結(jié)扎。

1.4 梗死面積計(jì)算 I/R 24 h后,采用腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉小鼠,剪開胸腔切取心臟,保留主動(dòng)脈。將心臟保存于 4℃生理鹽水中,將 23號(hào)針頭置入升主動(dòng)脈根部,不穿過主動(dòng)脈瓣,結(jié)扎固定。準(zhǔn)備 37℃ 3～4 m l的 TTC磷酸緩沖液(pH7.4),從主動(dòng)脈緩慢灌注心臟,當(dāng)心肌變?yōu)榇u紅色時(shí)停止注射。重新結(jié)扎 LAD。然后通過主動(dòng)脈均勻緩慢灌注約 2ml 2.5%的伊文思藍(lán),并使心肌缺血區(qū)域面朝上,防止流出的藍(lán)污染心臟表面。待心臟變藍(lán)后停止灌注并用生理鹽水充分沖洗,清潔心臟表面并擠壓心臟以排除殘留于心腔中伊文思藍(lán)。充分吸干心臟表面和心腔中的生理鹽水,保存于 -20℃冰箱中。待心臟冷凍固定后,將心臟置于切片器中,從心尖開始連續(xù)切厚度為 1mm的切片,一共 5片。采用高分辨率解剖顯微鏡對(duì)每片心肌組織兩面進(jìn)行拍照。采用 MetaVue Version 6.2r6分析軟件對(duì)切片分析,TTC染色后梗死區(qū)為白色,未梗死區(qū)為磚紅色,伊凡思藍(lán)染色后整片切片面積減去藍(lán)色區(qū)域?yàn)槿毖ｋU(xiǎn)區(qū)(AAR)。以 AAR/左心室區(qū)域(LV)百分比表示 AAR面積,梗死區(qū)/AAR百分比表示梗死面積。完畢后對(duì)每片心肌組織稱重。

2 結(jié)果

2.1 模型制備情況 實(shí)驗(yàn)組因麻醉意外死亡 1只,成功率為 95%(19/20)。假手術(shù)組均存活。

2.2 心電圖 ST段變化情況 實(shí)驗(yàn)組結(jié)扎 LAD后心電圖 QRS波高大增寬或 ST段弓背上抬,復(fù)灌后ST段下降 1/3以上,假手術(shù)組前后無變化。

2.3 梗死面積 經(jīng)過 TTC和伊文思藍(lán)染色,實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組 AAR面積分別為(59.5±0.9)%、(60.7±1.1)%,P＞0.05;實(shí)驗(yàn)組梗死面積為(32.2±0.7)%,假手術(shù)組無心肌梗死形成。

3 討論

I/R模型中采用無呼吸機(jī)支持胸外結(jié)扎法因心臟擠壓至胸腔外,嚴(yán)重影響心臟的電生理和泵功能,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,尤其在心肌缺血預(yù)處理時(shí),多次牽擠心臟導(dǎo)致死亡,造模成功率極低。在我們的實(shí)驗(yàn)方法中,合理使用小鼠呼吸機(jī),操作過程中心臟處于正常的解剖位置,對(duì)血流動(dòng)力學(xué)及心功能影響較小,術(shù)后存活率顯著提高。

必要的設(shè)備支持,扎實(shí)的手術(shù)基本功及必要的手術(shù)技巧對(duì)成功建模有重要意義。我們還有如下體會(huì):①肋間隙的選擇:肋間隙的選擇需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需要具體分析。如缺血前預(yù)處理模型的建立[4],因?yàn)槎唐趦?nèi)需要對(duì)心臟反復(fù)操作,并且操作位置主要在心耳下緣位置,所以相對(duì)單純 I/R模型,在開胸時(shí)應(yīng)適當(dāng)高出一肋間隙,于第 3肋間隙入胸。而在其他手術(shù)模型的建立,比如運(yùn)用電子順磁共振技術(shù)監(jiān)測(cè)心肌中氧分壓水平的實(shí)驗(yàn)[6],因?yàn)樾枰谛募≈兄踩胩结?我們選擇第5肋間隙進(jìn)入胸腔。②結(jié)扎部位:在我們的手術(shù)過程中,一般以左心耳最下緣作為解剖標(biāo)志點(diǎn)1,以肺動(dòng)脈圓錐作為解剖標(biāo)志點(diǎn) 2。在距離解剖位置點(diǎn) 1下方 2 mm左右進(jìn)針,從解剖標(biāo)志點(diǎn) 2出針。這樣避免了依靠肉眼尋找 LAD的主觀性,同時(shí)依靠固定的解剖位置,固定的入針出針部位,有效地控制缺血面積的范圍,模型重現(xiàn)性好。③進(jìn)針深度:我們的經(jīng)驗(yàn)是當(dāng)使用 7-0無損傷縫線的時(shí)候,進(jìn)針深度 0.5～1mm,當(dāng)針尖全部進(jìn)入心肌組織后,通過腕關(guān)節(jié)的作用水平化弧,至肺動(dòng)脈圓錐出,出針;同時(shí),為防止心臟因受進(jìn)針力量跟隨右偏,左手可持手術(shù)鑷以相反的方向控制心臟的偏移。④結(jié)扎松緊度:結(jié)扎時(shí)寧輕勿重,在手術(shù)過程中,只要缺血期間連同 LAD一起結(jié)扎的 10號(hào)聚乙烯小管沒有松脫,基本可成功建立缺血再灌注模型。如果用力過度會(huì)導(dǎo)致缺血后血管無復(fù)流現(xiàn)象,在 TTC染色切片中表現(xiàn)為整片心肌梗死。另外如果過度用力,會(huì)因縫線的切割作用撕裂上方的心肌組織。

TTC染色是作為判斷心臟受損程度重要方法,此類染料可以穿過細(xì)胞膜,可以進(jìn)行灌注染色。在整個(gè)染色過程中我們需要注意的是灌注針不要進(jìn)入心腔,停留在主動(dòng)脈瓣上方即可。恰當(dāng)?shù)目刂迫玖蟽H局限在 AAR而不滲透到正常的心肌組織中成為染色成敗的關(guān)鍵。我們的的經(jīng)驗(yàn)是通過簡單地觀察心外膜的染色情況和注意觀察 AAR與其他區(qū)域形成良好的界限時(shí)即停止灌注,同時(shí)應(yīng)保證缺血區(qū)域面朝上,以防從心臟中流出的伊文思藍(lán)污染其表面,影響結(jié)果。整個(gè)染色灌注過程緩慢推入同時(shí)保證心臟充分灌注是成功的重要因素之一。

總之,我們的方法相對(duì)簡單且成功率高,是建立小鼠 I/R模型的理想術(shù)式,可供相關(guān)研究參考。

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