王紀霞，王瑞華，王海波，孫明勝，楊國鋒，肖 賀，蔡克周，周存六*，陳從貴

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

血源性腌肉色素研究進展

王紀霞，王瑞華，王海波，孫明勝，楊國鋒，肖 賀，蔡克周，周存六*，陳從貴

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

硝酸鹽、亞硝酸鹽替代物的研究一直是肉類加工行業(yè)亟待解決的技術問題。本文對血源性腌肉色素的制備原理和方法及其性質和應用等研究現狀進行詳細綜述，指出目前腌肉色素研究存在的問題和今后努力的方向，為腌肉色素等相關研究提供借鑒。

配體；血紅蛋白；腌肉色素

Abstract：It has been an urgent issue to find an alternative to nitrate and nitrite in the field of meat industry. In this paper, the preparation principle and methods, properties and applications of cured cooked-meat pigments (CCMP) are reviewed. Meanwhile,the current problems as well as further research direction are also discussed. All of these investigations will be helpful fools for the further development of CCMP.

Key words：ligand；hemoglobin；cured cooked-meat pigments (CCMP)

色澤是腌制肉品的重要品質特性，是影響消費者作出購買決定的關鍵因素之一。硝酸鹽、亞硝酸鹽是傳統(tǒng)的腌制劑，具有呈色、呈味和抑制肉毒芽孢桿菌繁殖作用，也是目前最普遍使用的腌制劑之一。然而，亞硝酸離子能夠與氨基酸分解產物胺類化合物反應形成致癌物質，其安全性受到廣泛關注，硝酸鹽、亞硝酸鹽替代物的研究一直是肉類加工行業(yè)亟待解決的技術問題。

1 以血液為原料制備腌肉色素的理論依據

血紅蛋白由中心血紅素和外圍珠蛋白組成，血紅素由中心鐵離子和卟啉環(huán)組成。肌紅蛋白具有類似于血紅蛋白的結構[1]。通常，鐵離子呈二價，含有d層空軌道，具有接受配體提供的孤電子對、形成配位化合物的能力[2-3]。根據晶體場理論，當血紅蛋白、肌紅蛋白與配體配位，晶體場能降低、變得穩(wěn)定[4]。這是以血液為原料制備肉制品色素的理論依據。

2 腌肉色素制備

目前，亞硝基血紅蛋白(HbNO)是研究最為深入的血源性肉制品色素。Henry等[5]認為不論鐵的狀態(tài)是二價還是三價，NO均能夠與血紅素蛋白質螯合。20世紀70年代，前蘇聯(lián)莫斯科肉乳工藝學院的Pal'min等[6]最早提出使用腌肉色素概念，此時已有向裝有肌紅蛋白的試管內通入一氧化氮、直接反應制備亞硝基肌紅蛋白(MbNO)的實驗報道。Rubin[7]比較詳細地研究了腌肉色素，他們采用牛血中的血紅素與NO或NaNO2合成亞硝基亞鐵血紅素。Pegg等[8]利用血紅素與NO合成了腌肉色素，將NO的飽和溶液逐滴加入到血紅素溶液中，測定吸光度的變化曲線得知血紅素與NO是1:1結合的。在我國，曹穩(wěn)根等[9]依次以氫氧化鈉溶液加入至血紅細胞中提取血紅素，向該溶液加亞硝酸鈉反應、再加入胰蛋白酶分解，得到亞硝基血紅色素溶液?？妆ＨA等[10]利用豬血中的血紅素與一定量的亞硝酸鹽反應，經真空冷凍干燥合成制得腌肉色素。通過血紅素與N O或NaNO2制備的腌肉色素遇光、尤其遇空氣易褪色，在避光和無空氣的條件下，色素可保持30d左右，而暴露在空氣中僅能保持1d。很顯然，這樣的腌肉色素商業(yè)應用價值很小。為提高其保存期，采用包埋措施處理。經這種技術處理的腌肉色素，穩(wěn)定性有了一定提高，但仍未解決其穩(wěn)定性這一根本問題。

血紅蛋白具有血紅素結構單元，具備與NO配體配位的條件；其外圍有珠蛋白，因此，血紅蛋白比血紅素更穩(wěn)定。據此，張坤生[11]提出直接利用血紅蛋白與NO反應制備腌肉色素，其利用雞血制備血紅蛋白、再分別與NO或NaNO2制備腌肉色素。馬美湖等[12]利用NaNO2、異抗壞血鈉、尼克酰胺制備HbNO。與亞硝基血紅素相比，HbNO具有較高的穩(wěn)定性。但這種制備方法設備投入大、操作難、需要大量有機溶劑，不適合工業(yè)化生產。NO屬小分子配體，能夠穿透血細胞膜。利用這個性質，解萬翠等[13]以豬血細胞為原料，直接與亞硝酸鈉反應制備腌肉色素。坂田亮一等[14]以商業(yè)血紅蛋白粉配成溶液和亞硝酸鈉、抗壞血酸鈉制備腌肉色素。嚴聃[15]對HbNO合成進行改進，在酶的催化下有控制地酶法水解、再亞硝基化。與用純血紅蛋白合成的腌肉色素相比，該方法將蛋白質分子中的肽鍵有限水解切開，使血紅素暴露、NO更容易且牢固地結合其上生成亞硝基血紅素多肽。這種條件下的血紅素仍有較長的多肽鏈保護，因而穩(wěn)定性有了很大提高。

與亞硝基血紅素相比，H bN O具有較高的穩(wěn)定性，但這種腌肉色素見光易分解，需要穩(wěn)定化處理。O’Boyle等[16]對HbNO微膠囊化干燥工藝進行了研究，結果表明最適的微膠囊壁材是β-環(huán)糊精、變性淀粉和麥芽糊精，其中β-環(huán)糊精是必不可少的，經微膠囊化噴霧干燥的HbNO著色劑化學性質并沒有改變。邢紹平等[17]用蔗糖對HbNO進行糖基化處理、提高HbNO的穩(wěn)定性。經過微膠囊化或糖基化處理的HbNO穩(wěn)定性有一定程度的提高，但其穩(wěn)定性仍需進一步提高。

配體與血紅蛋白配位、導致晶體場能量降低，是血紅蛋白穩(wěn)定性提高的根本原因[4]。含有N、O、S等元素的分子具有提供孤對電子和與血紅蛋白中心鐵絡合的能力[3]。只要這些分子穿越其外圍珠蛋白并與血紅蛋白接觸，就有與血紅蛋白絡合的能力。近年來，利用其他配體與血紅蛋白絡合、制備腌肉色素的研究相繼展開?？娫狼俚萚18]以半胱氨酸為配體、與血紅蛋白絡合制備腌肉色素；王遠明[19]選用了煙酸、煙酰胺和TEA為配體、與血紅蛋白絡合制備腌肉色素；楊錫洪等[20-21]利用組氨酸為配體 與血紅蛋白絡合、再進行糖基化處理制備新型無硝腌肉色素。錢瑞生等[22]通過CO與血紅蛋白絡合、制備新型腌肉色素碳氧血紅蛋白。Silkstone等[23]描述了CO與肌紅蛋白結合過程中的動力學和光學轉化，認為血紅素中鐵離子結合的CO容易光解失去。Mark等[24]研究了低溫下CO和O2分別與肌紅蛋白和血紅蛋白結合的本質。在－265℃下，光化產物形成需要4×10-11s，光催化分解要用幾分鐘；O2的光化產物產率是0.4±0.1，而CO與肌紅蛋白和血紅蛋白的光化結合產率均為1.0±0.1。

3 腌肉色素性質

3.1 腌肉色素穩(wěn)定性

Shahidi[25]實驗表明pH值為5.5～5.7時，HbNO在充一氧化氮氣體的密封試管中能貯存幾個月。陶菲[26]研究不同條件下HbNO色素的穩(wěn)定性，結果表明：光照、氧化劑對腌肉色素有不良的影響，腌肉色素應盡量避光、真空保藏；Fe3+和Ca2+對色素的穩(wěn)定性影響較大，其他離子的影響較??；溫度、pH值對腌肉色素的影響不大。鄭立紅等[27]研究了光照、不同pH值、金屬離子、氧化劑H2O2、還原劑L-抗壞血酸和蔗糖對HbNO的影響。在紫外光、日光燈和陽光照射下，HbNO溶液的吸光度都沒有顯著的變化；感官評價表明色素的顏色沒有明顯變化；HbNO在pH值4～8的范圍內很穩(wěn)定，在pH值低于4或高于8的條件下不穩(wěn)定；在低濃度Na+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe3+、Sn2+等金屬離子存在時，HbNO在41h內無明顯變化，到113h時吸光度增加，并產生微渾濁的現象；在H2O2存在下，HbNO溶液的顏色由紅色變成黃色，說明HbNO已經變性；在有還原劑L-抗壞血酸存在時，HbNO比較穩(wěn)定；蔗糖不會影響HbNO的色調和色度。上述研究是通過測定色素在80%丙酮溶液中的吸光度的變化實現的，但也可以根據Gamasa等[28]利用多譜線成像測定肉中色素濃度的方法，測定色素中不同形態(tài)的含量，說明色素的穩(wěn)定性。肉中色素主要含有還原性肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白、氧化高鐵肌紅蛋白3種形態(tài)，可以使用3種肌紅蛋白形態(tài)色素的等吸收點(474、525、572、610nm)的比例來計算每種形態(tài)色素的濃度。與肌紅蛋白的存在形式類似，血紅蛋白也存在還原性血紅蛋白、氧合血紅蛋白和高鐵血紅蛋白3種形態(tài)，因此采用這種方法計算是可行的。Osawa[29]發(fā)現了一種便捷快速自動測定肉中色素的方法，該法為散射分光光度法，可以用該方法測定還原性肌紅蛋白含量來評價肉的新鮮度，也可以測定肌紅蛋白、血紅蛋白的濃度反映色素的穩(wěn)定性。王遠明[19]研究了豬血與煙酸、煙酰胺和TEA為配體制備著色劑的穩(wěn)定性，質量分數l%的該色素溶液置于陽光下照射3d(6月份的晴天)，著色劑含量下降了12.4%。楊錫洪等[30]利用組氨酸與血紅蛋白制備無硝色素(NHP)，將它與腌肉色素(CCMP)比較，發(fā)現5d日光照射后NHP的特異性吸收峰降低了41.9%，NHP渾濁，顏色最終為淺紅色；而CCMP很快變性、沉淀，說明N HP的光照穩(wěn)定性明顯優(yōu)于CCMP。兩種色素常溫下避光保存，CCMP保藏12個月時，吸光度降低了22%；而通過糖基化作用的NHP，穩(wěn)定性有所提高，吸光度僅降低了6%。Gomide等[31]測定了用CO處理過的豬血的顏色穩(wěn)定性。研究考察了不同pH值對豬血和CO處理過的豬血顏色的影響，以豬血的色度值L*(亮度)、a*(紅度)、b*(黃度)為指標評價。結果表明，在實驗的每個pH值(7.40、 6.70、6.00)條件下，用CO處理過的豬血穩(wěn)定性更高，顏色也會變成有吸引力的紅色；a*值和b*值增加，L*沒有顯著變化。

3.2 腌肉色素的毒性

Stevanovic等[32]研究了牛血紅細胞或氯化血紅素中間體制備的腌肉色素(CCMP)、以及按照SOS/um實驗(即環(huán)境誘變物的短期篩選實驗)和Ames測試法(污染物致突變性實驗)測定分別由CCMP和亞硝酸鹽著色的火腿的毒性。結果表明，SOS/umu法檢測中，CCMP、使用CCMP或亞硝酸鹽分別著色的火腿均沒有毒性。在Ames檢測中，使用鼠傷寒沙門氏菌菌株TA98和TA100分別檢測CCMP和亞硝酸鹽著色的火腿。在亞硝酸鹽著色的火腿中，只有當菌株沒有新陳代謝的時候TA100菌株會顯示出微弱的突變，而CCMP著色的火腿中的菌株沒有突變。與亞硝酸鹽著色的火腿相比，使用CCMP著色的火腿、殘余量顯著降低，因而安全性提高了。

3.3 腌肉色素的其他性質

張坤生等[33]用0.04mol/L的碳酸鈉溶液和純蒸餾水作溶劑，選擇超聲波、均質、磁力攪拌等方式，通過測定重力沉降后殘渣干燥后的質量比較色素的溶解性，結果表明：0.04mol/L的碳酸鈉溶液中用磁力攪拌色素的溶解性最好，溶解度達96.6%。施春權等[34]研究了pH值、NaCl濃度以及溫度對HbNO起泡性和持水性的影響，結果表明，HbNO溶液的起泡性與其溶解度有關。在pH5時，即HbNO的等電點處，HbNO溶液具有最低的起泡性；偏離等電點時，起泡性由于溶解度的增加而增大，泡沫穩(wěn)定性也相應提高。由于有鹽溶作用，低濃度的NaCl溶液使HbNO的起泡性增大，高濃度的NaCl溶液會使HbNO鹽析出來而造成其溶解度下降，起泡性降低；溫度對起泡性也有促進作用，但隨著溫度的升高，泡沫穩(wěn)定性降低；pH值、NaCl濃度以及溫度對HbNO持水性的影響與起泡性一致。施春權等[35]研究了pH值、NaCl濃度以及溫度對溶解性和乳化性的影響。結果表明，HbNO溶液在pH5處具有最低的溶解性，pH值越大溶解性越強；當溫度低于60℃時，溶解度隨溫度的升高而增大，當溫度高于60℃低于80℃時，溶解度輕微下降但不顯著。當NaCl濃度低于0.4mol/L時，即離子強度低于1.0時，溶解度隨NaCl濃度的升高而增大。當NaCl濃度高于0.4mol/L時，溶解度隨NaCl濃度的升高而降低。當溫度與濃度分別為60℃、0.4mol/L時蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性最高，溫度和NaCl濃度的升高和降低都可以降低HbNO的乳化性與乳化穩(wěn)定性。

4 腌肉色素應用

Oliver等[36]將豬血血紅素加入到PSE(蒼白、柔軟、多汁)的肉中、再制成火腿，研究了色素對火腿顏色、顏色穩(wěn)定性和質構的影響。結果表明，色素使火腿的L*值降低，a*值增加，從視覺上發(fā)現火腿變紅了，色素對顏色穩(wěn)定性和火腿質構沒有影響。

Sheridan等[37]采用兩種方法測定了火腿切塊后的顏色變化，一種是CIE法，用L*、a*、b*等參數表達肉的色澤，其重現性較差；另一種是分析變化中肉的顏色的反射光譜，能夠清楚的表明火腿褪色的不同階段。由血液制備的色素本身顏色比較深，加入到火腿中顏色變化程度不容易區(qū)分，適合使用反射光譜方法來測定。

Hornsey等[38]將制備的亞硝基血紅素色素加入到火腿中著色，然后用80%的丙酮溶液將火腿中的色素提取出來，測定紫外吸收光譜。將火腿光照24h后，再用相同的方法提取色素、并測定紫外吸收光譜。比較兩次提取色素的紫外光譜的變化，說明亞硝基血紅素色素改變并穩(wěn)定火腿中的色素成分，從而達到火腿的著色和色澤穩(wěn)定的效果。

馬美湖等[39]將HbNO作為發(fā)色劑加入到火腿中，其顏色為玫瑰紅色。HbNO色素中的殘留量低至7.05mg/kg。文中提到在加工火腿過程中，必須注意HbNO粉的添加程序，否則會影響HbNO在產品中的溶解性，使產品表面出現不溶性的黑色粒狀斑點。鄭立紅等[40]將HbNO分別應用于豬肉灌腸和雞肉灌腸中，以色度值和感官評價作為應用效果的評價標準。結果表明，以HbNO作為著色劑制成的火腿腸，感官狀態(tài)接近于亞硝酸鈉的發(fā)色效果，并且比紅曲色素的著色效果要好。HbNO有很強的耐熱性，可以使用到高溫香腸中。HbNO在豬肉腸和雞肉腸中的著色效果均良好。黃群等[41]將HbNO加入灌腸中著色，以發(fā)色率作為評價指標，得出了HbNO、抗壞血酸、煙酰胺用量的較佳組合。結果表明，加HbNO著色的產品與亞硝酸鈉發(fā)色的產品感官上無明顯差別。蔣云升等[42]將豬血制備的HbNO加入到香腸中，同時添加了產香發(fā)酵菌和天然抗氧化劑。結果表明，發(fā)酵菌能降解，從而降低的殘留量。但是這并不能說明肉毒梭狀桿菌也受到抑制而減少肉毒毒素的產生，不能消除肉毒毒素中毒隱患。施春權等[43]將豬血制備的HbNO與防腐劑復合加入到哈爾濱紅腸中，研究了HbNO對產品顏色、pH值、硫代巴比妥酸反應物值(TBARS)、菌落總數等方面的影響。結果表明：HbNO能夠增加紅腸的紅度值a*，降低TBARS值和菌落總數。未加防腐劑，只加HbNO的紅腸的菌落總數也有所降低，說明HbNO除了著色功能外也有抑菌作用。邢紹平等[17]研究了食鹽、葡萄糖和蔗糖等加工灌腸時常用輔料對HbNO穩(wěn)定性的影響，結果表明食鹽和蔗糖對HbNO的穩(wěn)定性沒有不良影響，葡萄糖對其穩(wěn)定性有增強的作用。這可能是由于葡萄糖有較強的還原性，對HbNO有保護作用。另外，L-抗壞血酸和L-抗壞血酸鈉具有很強的還原性，是肉制品中常用的發(fā)色劑及發(fā)色助劑。尼克酰胺(又稱煙酰胺)可以與肌紅蛋白結合形成穩(wěn)定的煙酰胺肌紅蛋白，難于被氧化，可防止肌紅蛋白在與HbNO接觸過程中被氧化變色，有利于增強HbNO的發(fā)色效果。因此建議在HbNO發(fā)色的同時加入L-抗壞血酸或L-抗壞血酸鈉與尼克酰胺的復合物以增強發(fā)色效果。

5 結 論

HbNO作為著色劑可使肉制品呈現良好色澤，與添加亞硝酸鈉的香腸相比、其他感官品質無明顯差別；但是，至今為止，沒有明顯研究證據表明HbNO能夠顯著抑制肉毒梭狀桿菌的繁殖，HbNO對光敏感、不夠穩(wěn)定。因此，以HbNO為色素添加到香腸中發(fā)色是可行的，色素的穩(wěn)定、及其如何抑制肉毒芽孢桿菌等問題仍然需要進一步解決。另外，利用其他小分子配體與血紅蛋白絡合制備肉制品色素，提高色素本身穩(wěn)定性、安全性也將是今后肉制品色素的一個研究方向。

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Research Progress in Cured Cooked-meat Pigments Derived from Blood

WANG Ji-xia，WANG Rui-hua，WANG Hai-bo，SUN Ming-sheng，YANG Guo-feng，XIAO He，CAI Ke-zhou，ZHOU Cun-liu*，CHEN Cong-gui
(School of Biology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

TS251.5

A

1002-6630(2010)19-0449-04

2010-06-24

國家大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目(091035951)；合肥工業(yè)大學大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目(2009cxsy207)；科技部科技人員服務企業(yè)行動計劃項目(2009GJC30045)；安徽省科技攻關項目(08010301080)

王紀霞(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為肉制品加工與品質控制。E-mail：chunfengfeiyang22@163.com*通信作者：周存六(1970—)，男，副教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：zhouc14@hfut.edu.cn