沈干,金鈺,陳德監(jiān),李昌

(南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院東院整形美容科,江蘇南京 210003)

日光是環(huán)境中促使皮膚老化的最重要因素,長(zhǎng)期 慢性的紫外線照射可引起皮膚細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化物增多,端粒序列縮短,使細(xì)胞壽命縮短,細(xì)胞死亡;同時(shí)長(zhǎng)期慢性的紫外線照射還使細(xì)胞分泌金屬蛋白酶增加,分解真皮的彈力纖維和細(xì)胞間基質(zhì)量,一旦膠原降解,則皮膚菲薄,產(chǎn)生皺紋,這就是皮膚的光老化。減少自由基的產(chǎn)生和清除老化代謝產(chǎn)物,提高抗氧化酶活性已成為目前延緩皮膚衰老的有效方法。在中草藥中尋找高效、無副作用的天然自由基清除劑的研究已日益成為醫(yī)藥學(xué)和日用化學(xué)品科學(xué)一個(gè)十分活躍的研究領(lǐng)域。本研究就人角質(zhì)形成細(xì)胞在中波紫外線(ultraviolet B,UVB)輻照后,中藥成分人參皂苷Rb1和紅景天苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的影響進(jìn)行觀察,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含10%小牛血清(杭州四季青生物公司)的RMPI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司),在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Heraeus)中培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞(由南京醫(yī)科大學(xué)駱丹教授惠贈(zèng))。傳代時(shí)以胰酶消化,以1×106ml-1的細(xì)胞濃度定量接種于96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞達(dá)70%融合時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(0 J?cm-2UVB照射組)、60 J?cm-2UVB+人參皂苷Rb1組(人參皂苷Rb1濃度分別為0、20、50、100μg?ml-1)、60 J?cm-2UVB+紅景天苷組(紅景天苷濃度分別為0、20、50、100μg?ml-1),每組3個(gè)孔,按照不同組別接受藥物和或照光處理,照光后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 紫外線照射

HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)予UVB照射,照射前先棄去各孔細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS清洗2遍后留少量PBS覆蓋細(xì)胞,與輻照燈管15 cm照射,然后棄覆蓋液,換回常規(guī)培養(yǎng)液。

應(yīng)用UVB輻照度監(jiān)示器(上海Sigma公司)標(biāo)定SUV-100日光紫外線模擬器(上海Sigma公司)的輻照度。UVB劑量=UVB輻照度 ×輻照時(shí)間(min)。在既往的研究基礎(chǔ)上,本研究選用的照射劑量是60 J?cm-2。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

UVB輻照后,分別在培養(yǎng)液中加入不同濃度的人參皂苷Rb1和紅景天苷。孵育24 h后加入MTT 20μl(5 ml?ml-1),再孵育4 h后棄去上清液,加入100μl二甲亞砜(DMSO),室溫振蕩15 min。使用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)測(cè)定每組吸光度值,空白試劑孔調(diào)零,讀取吸光度值,觀察各組細(xì)胞的增殖活性。

1.5 中藥對(duì)抗UVB照射所致氧化損傷作用的指標(biāo)檢測(cè)

以試劑盒(南京建成生物工程公司)檢測(cè)在UVB照射后加藥各組及未加藥對(duì)照組細(xì)胞的谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量,以吸光度值顯示其含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 在UVB照射后不同濃度的人參皂苷Rb1對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響

HaCaT細(xì)胞經(jīng)60 J?cm-2UVB照射后,加入人參皂苷Rb1,結(jié)果顯示,細(xì)胞增殖活性漸增強(qiáng)(P＜0.05),并且在一定濃度范圍內(nèi)隨人參皂苷濃度增加這種細(xì)胞保護(hù)作用增強(qiáng)(表1)。

表1 不同濃度人參皂苷Rb1在UVB(60 J?cm-2)照射后HaCaT細(xì)胞增殖活性的變化(±s)

表1 不同濃度人參皂苷Rb1在UVB(60 J?cm-2)照射后HaCaT細(xì)胞增殖活性的變化(±s)

與空白對(duì)照組比較,a P＜0.05

人參皂苷Rb1/μg?ml-1 HaCaT細(xì)胞增殖活性0 0.264 5±0.007 20 0.581 2±0.007a 50 0.607 7±0.007a 100 0.593 6±0.007a

2.2 在UVB照射后不同濃度的紅景天苷對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響

HaCaT細(xì)胞經(jīng)60 J?cm-2UVB照射后,加入紅景天苷,結(jié)果顯示細(xì)胞增殖活性漸增強(qiáng)(P＜0.05),并且隨紅景天苷濃度增加這種細(xì)胞保護(hù)作用增強(qiáng)(表2)。

表2 不同濃度紅景天苷在UVB(60 J?cm-2)照射后HaCaT細(xì)胞增殖活性的變化(±s)

表2 不同濃度紅景天苷在UVB(60 J?cm-2)照射后HaCaT細(xì)胞增殖活性的變化(±s)

與空白對(duì)照組比較,a P＜0.05

紅景天苷/μg?ml-1 HaCaT細(xì)胞增殖活性0 0.378 6±0.009 20 0.601 1±0.155a 50 0.6273±0.032a 100 0.6320±0.021a

2.3 人參皂苷Rb1對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞SOD、GSH、CAT活性和MDA含量的影響

與空白對(duì)照組相比,UVB照射后細(xì)胞SOD、GSH、CAT活性明顯下降,MDA含量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

60 J?cm-2UVB照射后,人參皂苷Rb1(20、50、100μg?ml-1)處理組與未加藥(0μg?ml-1)組相比,SOD、GSH、CAT活性明顯要高,分別高出了約3倍、2倍和2.5倍;而MDA含量在60 J?cm-2UVB照射后,人參皂苷Rb1組比未加藥組(0μg?ml-1)低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(表3)。

表3 不同濃度人參皂苷Rb1對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞SOD、GSH、CAT活性及MDA含量的影響(±s)

表3 不同濃度人參皂苷Rb1對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞SOD、GSH、CAT活性及MDA含量的影響(±s)

與空白對(duì)照組比較,a P＜0.05;與未加藥組比較,b P＜0.01

組 別SOD活性GSH活性MDA含量CAT活性空白對(duì)照組64.28±0.68 3.81±0.22 1.28±0.18 2.67±0.16 60 J?cm-2+人參皂苷Rb1 0μg?ml-1 13.62±2.21a 0.92±0.10a 4.30±0.18a 1.44±0.18a 20μg?ml-1 39.06±3.28b 2.04±0.55b 1.02±0.12b 2.28±0.08b 50μg?ml-1 43.35±2.09b 2.11±0.54b 1.26±0.26b 2.64±0.18b 100μg?ml-1 36.02±1.12b 1.89±0.11b 1.29±0.16b 1.86±0.09b

2.4 紅景天苷對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞SOD、GSH、CAT活性和MDA含量的影響

與空白對(duì)照組相比,UVB照射后細(xì)胞SOD、GSH、CAT活性明顯下降,MDA含量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

60 J?cm-2UVB照射后,紅景天苷(20、50、100μg?ml-1)處理組與未加藥(0μg?ml-1)組相比,SOD、GSH、CAT活性明顯要高,分別高出了約3.5倍、2.5倍和1.5倍;而MDA含量在60 J?cm-2UVB照射后,紅景天苷組比未加藥組(0μg?ml-1)低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表4 不同濃度紅景天苷對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞SOD、GSH、CAT活性及MDA含量的影響(±s)

表4 不同濃度紅景天苷對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞SOD、GSH、CAT活性及MDA含量的影響(±s)

與空白對(duì)照組比較,a P＜0.05;與未加藥組比較,b P＜0.01

組 別SOD活性GSH活性MDA含量CAT活性空白對(duì)照組64.28±0.68 3.81±0.22 1.28±0.18 2.67±0.16 60 J?cm-2+紅景天苷組0μg?ml-1 13.62±2.21a 0.92±0.10a 4.30±0.18a 1.44±0.18a 20μg?ml-1 45.05±0.99b 3.08±0.32b 3.04±0.30b 2.64±0.10b 50μg?ml-1 37.35±2.76b 2.72±0.07b 2.41±0.32b 2.17±0.14b 100μg?ml-1 39.76±2.29b 3.06±0.15b 2.14±0.11b 1.76±0.17b

3 討 論

皮膚是人體最大的器官,擔(dān)負(fù)著保護(hù)、感覺、調(diào)節(jié)體溫、分泌和排泄、吸收、代謝、免疫等諸多方面的功能。皮膚衰老是人體衰老的一個(gè)重要表現(xiàn)。皮膚老化分為兩種:一種是固有性老化,又稱自然老化,是由遺傳因素和不可抗力因素(如重力作用、機(jī)體內(nèi)分泌及免疫功能隨機(jī)體衰老的改變)引起的;另一種是由環(huán)境因素如紫外線、吸煙、風(fēng)吹及接觸化學(xué)物質(zhì)等引起的外源性老化。而由于日光的長(zhǎng)期反復(fù)照射是環(huán)境中影響皮膚老化的最重要因素,因此又稱光老化。自然光線中的紫外線對(duì)皮膚表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的都會(huì)造成損害,其中波長(zhǎng)在280～320 nm的紫外線(即UVA)由表皮吸收,波長(zhǎng)在320～400 nm的紫外線(即UVB)可作用于表皮細(xì)胞和真皮的成纖維細(xì)胞[1]。

日光中的紫外線通過下列機(jī)制使皮膚損傷:(1)損傷皮膚細(xì)胞的DNA;(2)進(jìn)行性蛋白質(zhì)(如膠原)的交聯(lián);(3)通過誘導(dǎo)抗原刺激反應(yīng)的抑制途徑而降低免疫應(yīng)答;(4)產(chǎn)生高度反應(yīng)的自由基與各種細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)相互作用而造成細(xì)胞和組織的損傷。紫外線還可直接抑制表皮朗格罕細(xì)胞的功能,引起光免疫抑制,使皮膚的免疫監(jiān)督功能減弱而引起皮膚的光老化,并且長(zhǎng)期光照的皮膚中微血管數(shù)量減少,使皮膚的營(yíng)養(yǎng)狀況較年輕的皮膚差,更易導(dǎo)致皮膚的老化。

分子機(jī)制方面,長(zhǎng)期慢性的紫外線照射可引起皮膚細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化物增多,可使端粒序列縮短,細(xì)胞壽命縮短,使細(xì)胞死亡;同時(shí)長(zhǎng)期慢性的紫外線照射還使細(xì)胞分泌金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)增加,分解真皮的彈力纖維和細(xì)胞間基質(zhì)量,其中MMP-1裂解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原,MMP-9裂解Ⅳ、Ⅴ型膠原以及明膠,這些膠原和明膠都是維持皮膚彈性和豐滿度重要成分,膠原降解可使皮膚菲薄,產(chǎn)生皺紋[2]。

很多研究關(guān)注紫外線誘導(dǎo)的氧化損傷[3],紫外線照射使人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT產(chǎn)生超氧陰離子,使細(xì)胞內(nèi)的H2O2大量增多,H2O2分解產(chǎn)生大量羥自由基,可引起細(xì)胞DNA斷裂[4],在角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡中起主要作用[5]。減少自由基的產(chǎn)生和清除老化代謝產(chǎn)物,提高抗氧化酶活性已成為目前延緩皮膚衰老的有效方法。在中草藥中尋找高效無副作用的天然自由基清除劑的研究,已日益成為醫(yī)藥學(xué)和日用化學(xué)品科學(xué)一個(gè)十分活躍的研究領(lǐng)域。

皂苷是中草藥中一類重要的活性物質(zhì),皂苷由甾體或三萜連接糖基組成,分子中含有較多的羥基,具有較大的極性。近年研究表明,皂苷大多具有明顯的抗氧化作用,而皂苷類物質(zhì)大多能提高體內(nèi)SOD、CAT等抗氧化酶的活性,從而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的功能,防止過多的氧自由基對(duì)機(jī)體的損害。

人參皂苷Rb1為人參的主要有效成分之一,已被證明有廣泛的藥理作用,如可明顯抑制腦、心和肝臟組織中過氧化脂質(zhì)形成,具有穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并增加其流動(dòng)性,延緩神經(jīng)細(xì)胞衰老及增智作用,甚至有抗癌等作用[6-7]。

紅景天為景天科景天屬多年生草本植物,其主要藥理活性成分為紅景天苷及其苷元酪醇、酪薩維、紅景天素等。近年來研究證明,紅景天苷具有抗疲勞、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基、增強(qiáng)記憶、改善睡眠等多種藥理作用[8]。

在我們的實(shí)驗(yàn)中,人參皂苷Rb1和紅景天苷均顯示了較強(qiáng)的光保護(hù)作用。我們選用人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT,即UVB主要作用的皮膚細(xì)胞進(jìn)行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該細(xì)胞在UVB(60 J?cm-2)輻照后,細(xì)胞增殖率下降,氧化損傷的各指標(biāo)也有顯著變化。本研究采用的60 J?cm-2UVB為適中輻照劑量,關(guān)于其他劑量UVB輻照對(duì)表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的影響我們將作繼續(xù)觀察。

細(xì)胞輻照后,使用人參皂苷Rb1和紅景天苷處理使細(xì)胞增殖活性較未用藥的對(duì)照組增高(P＜0.05),細(xì)胞SOD、GSH、CAT活性較未用藥的對(duì)照組明顯升高(P＜0.01);尤其是CAT指標(biāo)在人參皂苷Rb1組甚至高于無UVB照射的空白對(duì)照組;而MDA含量在UVB照射后,藥物作用組比未用藥組低(P＜0.01)。所有指標(biāo)顯示,這兩種藥物成分可以對(duì)抗UVB輻照后皮膚細(xì)胞的氧化損傷,起到很好的光保護(hù)作用。

在將來的試驗(yàn)中我們將采用分子生物學(xué)的手段檢測(cè)人參皂苷Rb1和紅景天苷作用后UVB照射的皮膚細(xì)胞的端粒酶活性、端粒長(zhǎng)度、金屬蛋白酶表達(dá)等指標(biāo),為中藥在抗皮膚光老化的應(yīng)用提供更科學(xué)的依據(jù)。

[1]李立,白雪濤.紫外線輻射對(duì)人類皮膚健康的影響[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2008,35(4);135-137.

[2]TRAUTINGER F.Mechanisms of photodamage of the skin and its functional consequences for skin ageing[J].Clin Exp Dermatol,2001,26(7):573-577.

[3]COLLINS A R,HORVATHOVA E.Oxidative DNA damage,antioxidants and DNA repair:applications of the comet assay[J].Biochem Soc Trans,2001,29(Pt 2):337.

[4]PETERSEN A B,GNIADECKI R,VICANOVA J,et al.Hydrogen peroxide is responsible for UVA-induced DNA damage measured by alkaline comet assay in HaCaT keratinocytes[J].J Photochem PhotobiolB,2000,59(1-3):123.

[5]WLASCHEK M,TANTCHEVA-POóR I,NADERI L,et al.Solar UV irradiation and dermal photoaging[J].J Photochem Photobiol B,2001,63(1-3):41-51.

[6]王本詳.人參抗衰老作用的探討[J].吉林醫(yī)學(xué),1983,4(1):57.

[7]李向高.人參皂苷Rb1的藥理作用研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,26(6):649-652.

[8]佟力,席軍.紅景天苷的藥理作用研究進(jìn)展[J].中外醫(yī)療,2008,27(27):137-138.