馬艷萍,朱承華

(1.上海梅山醫(yī)院眼科,江蘇南京 210039;2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科,江蘇南京 210029)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常見和最為嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,特別是增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)可引起糖尿病患者嚴(yán)重的視力喪失。據(jù)統(tǒng)計,2型糖尿病患者致盲原因中DR的致盲率為33%,1型糖尿病患者則高達(dá)86%[1]。玻璃體液是高惰性的,并且受血—視網(wǎng)膜屏障保護(hù),能間接反映視網(wǎng)膜分泌的細(xì)胞因子水平。玻璃體切割手術(shù)時獲得的玻璃體液使對人眼中細(xì)胞分子水平的研究成為可能。骨橋蛋白(steopontin,OPN)與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前增生性視網(wǎng)膜疾病研究的熱點,本實驗采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量測定OPN和VEGF含量,通過對PDR與非DR患者玻璃體液中OPN與VEGF含量的比較及分析,初步了解OPN和VEGF之間的關(guān)系,以及兩者與PDR發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科2008年3月至2008年12月28例(11男,17女)PDR患者(PDR組)的玻璃體液,年齡30～75歲;選取特發(fā)性黃斑裂孔(IMH)患者玻璃體液樣本24例(7男,17女)作對照組(IMH組),年齡52～77歲。兩組間年齡、性別差異均無統(tǒng)計意義。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照DR國際分類法(1983年),直接、間接眼底鏡檢查及眼B超和眼底熒光造影(FFA)檢查結(jié)果。兩組均行現(xiàn)代閉合式玻璃體切割手術(shù),排除眼外傷、高度近視以及眼底靜脈阻塞等引起的玻璃體視網(wǎng)膜病變等病例。

1.2 標(biāo)本采集

玻璃體液取樣:開瞼后以0.5 g?L-1碘伏稀釋液消毒結(jié)膜囊,無菌生理鹽水反復(fù)沖洗,無菌紗布吸盡結(jié)膜囊中殘液,在玻璃體腔灌注前由睫狀體平坦部抽取玻璃體液樣本,約0.2 ml,標(biāo)本移至已消毒并硅化的0.5 ml Eppendorf管,存放于-70℃冰箱備用。

1.3 實驗材料

人OPN試劑盒(human osteopontin immunoassay,catalog number DOST00,美國R＆D公司產(chǎn)品),∑550型酶標(biāo)儀(美國),Taq酶(5 U?μl-1,美國Invitrogen公司),IQ5熒光定量儀(BIO-rad公司)。

1.3.1 玻璃體液OPN與VEGF濃度測定 從冰箱中取出標(biāo)本,置于室溫下10 min待測。根據(jù)ELISA試劑盒的說明,將標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液定比稀釋,充分混勻。將酶標(biāo)板各孔依次編號,每孔加RD1-6 100μl,并加入50μl標(biāo)準(zhǔn)液或樣品,混勻封口。室溫下孵化2 h,棄液,沖洗液清洗4次。每孔加入200μl OPN Conjugate,封口室溫下孵化2 h。棄液,沖洗液清洗4次。避光情況下每孔加入200μl底物顯色溶液,混勻,孵化30 min。再每孔加50μl反應(yīng)終止液,混勻。酶標(biāo)儀550 nm處讀數(shù),30 min內(nèi)測定各孔吸光度值(A值)。VEGF測定方法類似。根據(jù)定比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以樣品的A值和標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品中OPN與VEGF的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

見表1。

表1 PDR與IMH組玻璃體液中OPN與VEGF水平(±s)

表1 PDR與IMH組玻璃體液中OPN與VEGF水平(±s)

組 別n OPN/ng?ml-1 VEGF/pg?ml-1 PDR組28 883.39±151.12 1158.68±140.98 IMH組24 537.88±166.37 295.91±109.62 P值 ＜0.01＜0.01

由表1可見PDR組OPN及VEGF表達(dá)均較IMH組增高(P＜0.01)。經(jīng)分析PDR組OPN與VEGF相關(guān)性回歸方程為Y=549+0.690X,見圖1。

3 討 論

圖1 PDR患者玻璃體中OPN與VEGF水平的相關(guān)散點圖(r=0.69,P＜0.01)

PDR的病理機制是血—視網(wǎng)膜屏障的破壞及視網(wǎng)膜新生血管形成造成的玻璃體視網(wǎng)膜增生性改變。OPN是一種帶負(fù)電荷的分泌性磷酸化糖蛋白,它具有鈣結(jié)合域、凝血酶裂解位點、整合素以及RGD結(jié)合序列等多個功能結(jié)合區(qū),可由多種組織細(xì)胞合成與分泌,其在許多系統(tǒng)疾病中被發(fā)現(xiàn)。OPN參與多種組織細(xì)胞損傷的修復(fù)過程,有促細(xì)胞移動、黏附和增生分化等功能,是一種增生相關(guān)蛋白[2]。在基因水平的研究[3]已經(jīng)證實,OPN在增生相關(guān)性疾病中顯著高表達(dá),但在PDR中對OPN的臨床研究目前還較少。動物研究[4]證實:OPN多存在于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層,在其他視網(wǎng)膜層分布較弱。本研究測得PDR病例玻璃體液中OPN濃度為(883.39±151.12)ng?ml-1,較IMH組(非糖尿病)[(537.88±166.37)ng?ml-1]明顯升高。另有研究[5]對PDR病例玻璃體液中OPN與血漿中OPN水平進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)其濃度明顯高于血漿,故非血眼屏障破壞等因素可以解釋玻璃體液中OPN濃度高于血漿中OPN濃度,說明PDR病例玻璃體中的OPN可能由眼內(nèi)產(chǎn)生,提示了OPN水平升高可能在增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理過程中起了一定的作用。Chidlow等[4]以興奮性中毒和局部缺血損傷后的小鼠模型視網(wǎng)膜進(jìn)行了OPN表達(dá)的時間和定位檢測,通過mRNA分析和免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn),在模型眼中出現(xiàn)了OPN mRNA上調(diào),具體產(chǎn)生的細(xì)胞尚不明確,增高的OPN通過RGD序列和與視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的整合素受體結(jié)合后引起聚集黏附激酶(FAK)磷酸化,通過Grb2/SOS或FAK/Src激活Ras、MAPK途徑,調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白組裝,細(xì)胞的聚集、黏附,血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和視網(wǎng)膜新生血管的生成。

血管源性因子是導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜細(xì)胞異常增生和新生血管生成的主要原因。前期研究[6]揭示,VEGF及其受體在正常角膜各層均有表達(dá),但表達(dá)量很低,而在眼部一些疾病中則高表達(dá),能促使內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移,蛋白水解和病理性血管生成。VEGF能特異性作用于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞,是最直接的眼內(nèi)新生血管形成因子。大量臨床研究[7]顯示,DR患者玻璃體和視網(wǎng)膜VEGF水平升高,且隨著DR嚴(yán)重程度的增加,VEGF相應(yīng)增多,其受體水平也隨之升高。缺氧可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-l,HIF-1)的活性增強,上調(diào)VEGF等血管形成因子的表達(dá),產(chǎn)生的VEGF通過與其特異性受體結(jié)合激活其下游的一系列蛋白,如激活磷脂酶C,水解磷脂酰肌醇二磷酸,產(chǎn)生二脂酰甘油DAG和肌醇三磷酸IP3,DAG可激活胞漿內(nèi)蛋白激酶C,進(jìn)而啟動細(xì)胞內(nèi)系統(tǒng),主要對毛細(xì)血管后靜脈和小靜脈施加影響,增加其通透性,可使血液中的大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)中,形成纖維蛋白凝膠等,有利于新生血管和基質(zhì)細(xì)胞生長[8]。同時VEGF還可以誘導(dǎo)蛋白水解酶、組織因子、基質(zhì)膠原酶等在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá),激活第Ⅶ因子從內(nèi)皮細(xì)胞釋放,改變細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和浸潤,以利于血管生成[9]。反面證據(jù)是向鼠眼內(nèi)注入VEGF受體Flt或Flk拮抗劑,可分別使視網(wǎng)膜新生血管形成減少100%和95%[10]。在本研究中,PDR患者玻璃體VEGF的平均含量[(1 158.68±140.98)pg?ml-1]明顯高于對照組(IMH組)的[(295.91±109.62)pg?ml-1],與國外報道一致。通過VEGF平均濃度的比較更直接地反映了新生血管活動性的水平,驗證了VEGF在PDR的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

本實驗統(tǒng)計分析表明,玻璃體液的OPN與VEGF含量呈顯著正相關(guān)(r=0.69,P＜0.01)。Shijubo等[11]研究證實,在腫瘤生成的病理機制中VEGF能誘導(dǎo)OPN水平升高,進(jìn)一步導(dǎo)致上皮細(xì)胞遷移,使新生血管生成促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移,但具體機制尚不清楚。因此,我們推測,在PDR患者由視網(wǎng)膜微循環(huán)缺氧作為始動因素,導(dǎo)致OPN和VEGF水平上調(diào),兩者作用于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞不同的受體,通過不同的途徑共同促進(jìn)病理性視網(wǎng)膜新生血管的形成。

綜上所述,我們的研究結(jié)果提示,OPN和VEGF共同參與PDR患者病理性新生血管的形成過程。但由于PDR形成涉及多種因子,可能存在多條影響途徑,故其具體增生機制仍是困擾人們的一個難題。病理情況下OPN的分布,何種視網(wǎng)膜細(xì)胞分泌來源,OPN分泌與病程時間、相關(guān)細(xì)胞因子之間的關(guān)系以及OPN發(fā)揮生理功能的具體通路,何種藥物能夠減少OPN的生成等仍不清楚,需要我們今后進(jìn)一步的研究來明確,為PDR的預(yù)防和治療引入新的有效思路和方法。

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