谷化平

(中國(guó)人民解放軍第251醫(yī)院 病理科,河北 張家口 075000)

膀胱尿路上皮癌(uroepithelium carcinoma of bladder,BUC)是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率在我國(guó)的泌尿系惡性腫瘤中占首位。近年來研究證明,BUC的發(fā)生、發(fā)展是一種復(fù)雜過程,與多個(gè)基因和多種分子水平變化密切相關(guān)。CD44v6是在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)移過程中通過其結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生顯著變化而影響腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移行為的典型的細(xì)胞表面黏附分子[1-4];p63是p53基因內(nèi)家族中的一員,廣泛分布于復(fù)層上皮細(xì)胞的基底層和單層上皮組織的基底細(xì)胞中,被認(rèn)為是可能參與上皮組織的正常發(fā)生和分化以及形態(tài)學(xué)的發(fā)生,并可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[4-8]。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)BUC和正常膀胱黏膜組織中CD44v6和p63蛋白表達(dá)情況,旨在探討這兩種基因蛋白表達(dá)與BUC的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及其生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

取我院2005年1月至2009年3月間手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷為BUC標(biāo)本60例。其中男51例,女9例;年齡30～78歲,平均(63.89±7.45)歲。病理分級(jí)按WHO標(biāo)準(zhǔn):G1～G239例,G321例;臨床分期按TNM標(biāo)準(zhǔn):淺表性腫瘤Tis～T125例,浸潤(rùn)性腫瘤T2～T435例;原發(fā)癌34例,復(fù)發(fā)癌26例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者20例,無轉(zhuǎn)移者40例。取同期距腫物1 cm以外的正常膀胱黏膜組織20例作為對(duì)照觀察,標(biāo)本經(jīng)40 g?L-1甲醛固定,石蠟包埋,4μm厚連續(xù)切片。

1.2 試劑

鼠抗人CD44v6、p63單克隆抗體和LSAB試劑盒均為丹麥Dako公司產(chǎn)品(均為即用型)。

1.3 方法

免疫組織化學(xué)染色采用微波-鏈霉親和素-生物素(microwave-labelledstrept-avidin biotin,MW-LSAB)技術(shù),即將切片常規(guī)脫蠟水化后,放入枸櫞酸緩沖液(10 mmol?L-1,pH 6.0)內(nèi),用微波儀170 W輻射5 min,冷卻后水洗.其他操作流程同常規(guī)LSAB法,所不同的是3步抗原孵育和正常血清封閉用微波儀130 W分別輻射5 min,然后保溫2 min。實(shí)驗(yàn)用已知CD44v6和p63陽性宮頸癌組織作為陽性對(duì)照,用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。H2O2-DAB顯色。

1.4 結(jié)果判斷

免疫組織化學(xué)染色呈棕黃色為陽性。CD44v6蛋白以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜、p63蛋白以細(xì)胞核顯示棕黃色顆粒為陽性。采用單盲法,每張切片在400倍顯微鏡下選10個(gè)視野,計(jì)算陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。未見棕黃色顆粒為陰性(-),陽性細(xì)胞數(shù) ＜25%為弱陽性,25%～75%為陽性,＞75%為強(qiáng)陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

CD44v6和p63蛋白表達(dá)陽性率比較采用 χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CD44v6和P63蛋白在正常膀胱黏膜和BUC中的表達(dá)

CD44v6蛋白陽性細(xì)胞的棕黃色染色定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜,背景清晰。CD44v6蛋白在正常膀胱黏膜組織中陽性細(xì)胞主要局限于黏膜上皮的基底細(xì)胞層及上基層細(xì)胞,表層細(xì)胞無表達(dá)(圖1);在BUC中陽性呈彌漫性分布,且細(xì)胞分化越低,CD44v6蛋白表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng),分化高的腫瘤細(xì)胞呈弱陽性或陰性(圖2);BUC組織中CD44v6蛋白陽性表達(dá)率和強(qiáng)陽性表達(dá)率顯著高于正常膀胱黏膜組織(χ2=6.73或 χ2=14.24,P＜0.05)。

圖1 正常膀胱黏膜基底細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜CD44v6陽性染色微波-LSAB法×200Fig 1 Immunohistochemistry,positive CD44v 6 expression in cytoplasm and cellular membrane of normal epithelium tissues WM-LSAB×200

圖2 BUC細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜CD 44v6陽性染色 微波-LSAB法×200Fig 2 Immunohistochemistry,positive CD44v 6 expression in cytoplasm and cellular membrane of BUC WM-LSAB×200

p63蛋白陽性細(xì)胞的棕黃色染色定位于細(xì)胞核,背景清晰,所有切片細(xì)胞均呈不同程度陽性反應(yīng)。在正常膀胱黏膜組織中,p63蛋白陽性細(xì)胞主要局限于黏膜上皮的基底細(xì)胞層及上基層細(xì)胞(圖3);在BUC組織中p63蛋白主要呈強(qiáng)陽性表達(dá)(圖4),且細(xì)胞分化越低,p63蛋白表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng),分化高的腫瘤細(xì)胞呈弱陽性或陰性;BUC組織中p63蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)率顯著高于正常膀胱黏膜組織(χ2=18.11,P＜0.05)。CD44v6和p63蛋白在正常膀胱黏膜和BUC組織中的表達(dá)見表1。

圖3 正常膀胱黏膜基底細(xì)胞核p 63蛋白陽性染色 微波-LSAB法 ×400Fig 3 Immunohistochemistry,positive p 63 protein expression in cellular nucleus membrane of normal epithelium tissues WMLSAB×200

圖4 BUC細(xì)胞核p 63蛋白陽性染色 微波-LSAB法×200Fig 4 Immunohistochemistry,positive p 63 protein expression in cellular nucleus of BUC WM-LSAB×200

表1 CD44v6和p63蛋白在正常膀胱黏膜和BUC中的表達(dá)Tab 1 Expression of CD44v6 and p63 protein in normal epithelium tissues and BUC

2.2 CD44v6和p63表達(dá)與BUC臨床病理特征的關(guān)系

隨著BUC病理分級(jí)和臨床分期的增高及術(shù)后復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,CD44v6表達(dá)的陽性率和強(qiáng)陽性率、p63表達(dá)的強(qiáng)陽性率均顯著增高(P＜0.05),見表2。

表2 CD44v6和p63表達(dá)與BUC臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Tab 2 Relationship between expression of CD44v6 and p63 protein in BUC and clinicopathologic characteristics

3 討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段,受多因素、多種基因及因子調(diào)控的復(fù)雜過程,其中任何一種基因或因子的異常表達(dá)均可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生或轉(zhuǎn)移。CD44屬Ⅰ類膜蛋白,是一類介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間產(chǎn)生相互黏附作用的細(xì)胞黏附分子。其在人體組織中分布極為廣泛,主要參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞于基質(zhì)之間的特異性粘連過程,從而維持組織與器官的基本結(jié)構(gòu)。CD44分為2種類型,即標(biāo)準(zhǔn)型CD44(CD44s)和變異型CD44(CD44v)?；蚪M分析表明,變異型CD44包括CD44v1～v10,其中與腫瘤轉(zhuǎn)移較為密切的是CD44v6。其促進(jìn)轉(zhuǎn)移作用機(jī)制可能是表達(dá)CD44v6蛋白的腫瘤細(xì)胞與淋巴管或血管內(nèi)某一配體結(jié)合,使轉(zhuǎn)移至那里的腫瘤細(xì)胞更加穩(wěn)定地寄宿與生長(zhǎng),由此形成轉(zhuǎn)移瘤。近年研究[1-4]證實(shí),CD44v6蛋白和轉(zhuǎn)錄分子水平的過量表達(dá)與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。p63基因是1998年在人類及大鼠基因組中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與p53同源的基因家族新成員,定位于3q27-3q29,其與p53具有十分相似的結(jié)構(gòu)和功能。p63正常主要表達(dá)于許多上皮組織的基底層,對(duì)各上皮和間葉組織正常發(fā)生、分化以及形態(tài)學(xué)的發(fā)生具有重要作用,被視為可能是與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因。p63基因在腫瘤中的高表達(dá),可以抑制野生型p53的活性,阻止野生型p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。近年來研究發(fā)現(xiàn),p63蛋白主要表達(dá)于肺鱗癌、宮頸鱗癌、皮膚鱗癌、食管癌和鼻咽癌等鱗狀上皮起源的腫瘤組織中,且隨著分化程度的升高而減低,并與其惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等預(yù)后不良的生物學(xué)行為密切相關(guān)[4-7]。由于p63蛋白在腺癌組織中的表達(dá)極低或不表達(dá),因此認(rèn)為,p63蛋白的表達(dá)可能與某種程度的鱗狀上皮相關(guān)性基因的表達(dá)潛能有關(guān)。近年來,有關(guān)p63蛋白在膀胱癌中的研究已見少數(shù)報(bào)道,結(jié)果提示,p63蛋白在尿路上皮的分化、細(xì)胞增殖中起一定作用,可能參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展,促成腫瘤的進(jìn)展,p63蛋白高表達(dá)與其腫瘤的病理分級(jí)和臨床分期密切相關(guān),因此認(rèn)為,p63蛋白是評(píng)估膀胱癌預(yù)后的潛在因素之一[8]。本研究結(jié)果顯示,在正常膀胱黏膜組織中CD44v6和p63蛋白僅表達(dá)于基底層及上基層細(xì)胞;在BUC組織中CD44v6和p63蛋白表達(dá)陽性率分別為63.3%和100%,陽性細(xì)胞呈彌漫性分布,且主要為強(qiáng)陽性表達(dá)。表明CD44v6和p63蛋白主要存在于正在增殖或具有增殖能力的膀胱尿路上皮細(xì)胞中,與BUC細(xì)胞的增殖、惡性轉(zhuǎn)化以及癌細(xì)胞的惡性程度密切相關(guān),可能是BUC的早期事件。本研究將BUC病理分級(jí)、臨床分期、原發(fā)癌與復(fù)發(fā)癌以及有無淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組進(jìn)行了觀察比較,發(fā)現(xiàn)隨著BUC的病理分級(jí)和臨床分期增高、腫瘤復(fù)發(fā)以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,CD44v6蛋白表達(dá)的陽性率和強(qiáng)陽性率及p63蛋白表達(dá)的強(qiáng)陽性率均隨之顯著性增高(P＜0.05),提示CD44v6和p63蛋白表達(dá)越強(qiáng),腫瘤細(xì)胞越具有較強(qiáng)的惡性增殖活性和轉(zhuǎn)移能力,預(yù)示患者臨床預(yù)后不良。我們認(rèn)為,在臨床病理活檢中,檢測(cè)BUC組織中CD44v6和p63蛋白表達(dá),不僅對(duì)研究BUC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)較可靠的重要標(biāo)志物,而且在判斷腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)測(cè)患者預(yù)后方面也是一個(gè)較可靠的、具有較大價(jià)值的參考指標(biāo)。

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