智曉東，呂剛

（遼寧醫(yī)學(xué)院 附屬第一醫(yī)院骨外科，遼寧 錦州 121001）

骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stems cells，MSC）是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，以其多胚層分化、低免疫原性、取材方便、容易擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，成為眾多干細(xì)胞當(dāng)中最受青睞的一個。近年來，將其分化為肝細(xì)胞［1］、心肌細(xì)胞［2］、成骨細(xì)胞［3］等的研究層出不窮。神經(jīng)元以其不可再生性，使得恢復(fù)其功能難度很大。因而，研究者們渴望通過一種較好的方法誘導(dǎo)分化MSC為神經(jīng)元樣細(xì)胞［4］，以修復(fù)損傷的神經(jīng)元，恢復(fù)其功能。到目前為止，誘導(dǎo)分化的方法大致分3種，應(yīng)用化學(xué)藥物［5］、生物制劑［6］或者基因轉(zhuǎn)染［7］。然而，至今仍沒有取得理想的效果。本研究應(yīng)用雪旺細(xì)胞與MSC細(xì)胞共培養(yǎng)，對于雪旺細(xì)胞是否可以促進(jìn)MSC分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞作一探討。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

SD大鼠購置于遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）。小鼠Brdu抗體和Brdu購置于Sigma公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗小鼠IgG抗體購置于北京中杉金橋有限公司，兔抗大鼠CD44、CD45抗體購置于博士德，兔抗大鼠NSE、S-100蛋白抗體購置博士德，DMEM、胎牛血清購置于美國Gibco公司，Ⅱ型膠原酶購置于Sigma公司。

1.2 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

取1只4~6周正常SD大鼠的股骨和脛骨，用PBS洗凈，去掉干骺端，用1 ml無菌注射器，吸取1 ml篩選培養(yǎng)基［含2 mmol/L的L-谷氨酰胺、1%青霉素和1%鏈霉素、9%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和 9%馬血清（horse serum，HS）的低糖DMEM］，沖出骨髓，每只鼠的骨髓吹打均勻后，靜置5 min，以2×106/ml接種到25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24~48 h后，換液，棄去未貼壁細(xì)胞，PBS洗3次，每3~4 d換液1次，待細(xì)胞90%融合后用0.25%的胰酶和0.02%EDTA消化3~5 min傳代，含血清的培養(yǎng)基終止消化，1 000 rpm，5 min離心，收集細(xì)胞1∶2傳代，用擴(kuò)增培養(yǎng)基（含2 mmol/L的L-谷氨酰胺、1%青霉素和1%鏈霉素、9%FBS和9%HS的IMDM）再培養(yǎng)，記作一代，取二、三代細(xì)胞做誘導(dǎo)分化。

1.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

取2~3代的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以2×105/ml接種于6孔板的蓋玻片上，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后取出6孔板，PBS漂洗3次，加入4%甲醛固定 30 min，0.1%TritonX-100通透 20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，加入1%BSA常溫封閉 30 min。加入兔抗鼠 CD44、CD45抗體（1∶100）孵育過夜，PBS漂洗3次，每次5 min，加入FITC標(biāo)記抗兔IgG抗體，常溫孵育30 min，90%甘油封片，熒光顯微鏡觀察，照像。

1.4 雪旺細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

取SD大鼠3只，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（30 mg/kg），剪下坐骨神經(jīng)，D-Hank′s液漂洗3次，加入0.25%胰酶和0.2%的膠原酶混合消化37℃，50 min，每5 min震蕩1次。完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min。用完全培養(yǎng)基（含2 mmol/L的L-谷氨酰胺、1%青霉素和1%鏈霉素、15%胎牛血清的DMEM）以8×105/ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。每3~4 d更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞80%融合時，用0.25%的胰酶和0.02%EDTA，消化3~5 min傳代。然后細(xì)胞1∶2重新接種，傳代。鑒定后用第3代的細(xì)胞做共培養(yǎng)誘導(dǎo)。

1.5 雪旺細(xì)胞的鑒定

消化收集培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞，將細(xì)胞以2×105/ml接種于6孔板的蓋玻片上，24 h后，用PBS漂洗，4%甲醛固定，30 min，0.1%TritonX-100 通透 20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，加入1%BSA常溫封閉30 min。加入兔抗鼠S-100蛋白抗體，PBS漂洗，加入FITC標(biāo)記抗兔IgG抗體，常溫孵育30 min，90%甘油封片，熒光顯微鏡觀察，照像。

1.6 雪旺細(xì)胞與MSC細(xì)胞共培養(yǎng)

取MSC細(xì)胞用10μmol/L的Brdu脈沖標(biāo)記1 h，PBS漂洗，消化收集，用DMEM/F12懸浮，與雪旺細(xì)胞1∶1混合，均以1×105/ml加入含有蓋玻片的6孔板。每3~4 d天換1次液，10 d后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化、照像。

1.7 誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)元樣細(xì)胞鑒定

1.7.1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測NSE和Brdu表達(dá)：用PBS漂洗3次培養(yǎng)板，4%甲醛固定，30 min，0.1%TritonX-100通透 30 min，PBS漂洗 3次，每次 5 min，加入1%BSA常溫封閉30 min。加入兔抗鼠NSE抗體和鼠抗Brdu抗體（1∶100稀釋），PBS漂洗，加入FITC標(biāo)記抗兔IgG抗體和羅丹明標(biāo)記抗鼠抗體（1∶200稀釋），常溫孵育30min，90%甘油封片，熒光顯微鏡觀察，照像，用NSE/Brdu（%）計數(shù)分化率。

1.7.2 形態(tài)學(xué)觀察測定神經(jīng)突觸長度：隨機(jī)選擇兩個細(xì)胞集落，測量10個神經(jīng)元樣細(xì)胞突出長度。比較MSC和神經(jīng)元樣細(xì)胞差別。

1.7.3 免疫印跡檢測NeuN的表達(dá)：將細(xì)胞樣品用TBS漂洗后加入RIPA緩沖液（1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、1%SDS、0.1%PMSF）裂解細(xì)胞，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度。加熱變性，SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入1∶1 000稀釋的一抗雜交2 h，TBST洗膜后加入二抗溫育1 h，TBST洗膜后進(jìn)行BCIP/NBT顯色，采用Chemigenius凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達(dá)量。betaactin為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析所有數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用x±s表示，采用t檢驗統(tǒng)計方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定（圖1，2）

形態(tài)學(xué)觀察顯示，圖2A為MSC細(xì)胞CD45的表達(dá)，圖中染成綠色的即是細(xì)胞CD45；圖2B為雪旺細(xì)胞S-100表達(dá)情況，可見細(xì)胞質(zhì)被染成綠色。

2.2 雪旺細(xì)胞對MSC分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察：MSC細(xì)胞與雪旺細(xì)胞共同培養(yǎng)10 d后可見雪旺細(xì)胞與MSC細(xì)胞可以共生，并且雪旺細(xì)胞在MSC集落旁邊，MSC分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞，呈放射狀排列，細(xì)胞變成長梭形，有突觸樣結(jié)構(gòu)（圖3）。

2.2.2 神經(jīng)突觸測量：可見共培養(yǎng)組細(xì)胞的長度為（12.18±0.92）μm，MSC 組的長度為（10.32±0.89）μm，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.2.3 NSE免疫熒光結(jié)果：共培養(yǎng)10 d后，分化后的神經(jīng)元樣細(xì)胞免疫熒光染色顯示NSE與Brdu的表達(dá)情況如圖4所示，標(biāo)記了Brdu的MSC細(xì)胞被染成紅色，位于細(xì)胞核內(nèi)，NSE用綠色熒光表示，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。細(xì)胞同時表達(dá)NSE和Brdu的為成功分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞，而對照組MSC細(xì)胞中，NSE表達(dá)弱，并且陽性細(xì)胞很少。雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)組的神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化率較高為（80.51±5.65）%；而對照組MSC細(xì)胞的分化率較低，為（58.99±6.62）%。二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.2.4 NeuN免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：由圖5可見，共培養(yǎng)后的細(xì)胞表達(dá)NeuN而MSC細(xì)胞不表達(dá)，雪旺細(xì)胞弱表達(dá)。

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多向分化潛能的干細(xì)胞，近年來將其誘導(dǎo)分化為各種細(xì)胞的研究頗多［8~11］。到目前為止，還沒有一種方法取得了很好的效果。Pittenger等［12］的1999年報道化學(xué)誘導(dǎo)方法出現(xiàn)典型神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的比率為（86.8±2.7）%，但神經(jīng)細(xì)胞存活時間較短，2006年Choi等分析經(jīng)RA誘導(dǎo)分化3 h后形態(tài)神經(jīng)元化的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元標(biāo)志的表達(dá)雖在3 h后明顯增加，但24 h后即下降［13］；基因轉(zhuǎn)染［14］方法能夠獲得純度較好，細(xì)胞功能穩(wěn)定的細(xì)胞，然而由于其技術(shù)要求高，復(fù)雜程度高，尤其是其長期效應(yīng)不清等原因難以廣泛應(yīng)用實施；生物誘導(dǎo)劑方法毒性小，效果比較好，之前的研究認(rèn)為，若想定向分化干細(xì)胞，常用目的細(xì)胞的成分來分化［15~17］，關(guān)于應(yīng)用周圍神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)MSC分化位神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究尚未見報道。

本研究結(jié)果顯示，共培養(yǎng)10 d后的MSC集落周圍的細(xì)胞明顯變長，突觸明顯變長，細(xì)胞形態(tài)與MSC明顯不同（P<0.05）。經(jīng)NSE/Brdu染色發(fā)現(xiàn)，分化后的細(xì)胞（神經(jīng)元樣細(xì)胞）胞質(zhì)內(nèi)明顯有NSE表達(dá)，陽性率遠(yuǎn)高于MSC細(xì)胞（P<0.01）。蛋白印跡結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)元樣細(xì)胞內(nèi)NeuN的表達(dá)明顯高于MSC細(xì)胞。NeuN是神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物，經(jīng)共培養(yǎng)后的MSC細(xì)胞能夠表達(dá)NeuN說明MSC可以經(jīng)雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)而分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。從形態(tài)學(xué)與NSE、NeuN染色可見，將MSC細(xì)胞與雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)可以使MSC細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，即雪旺細(xì)胞作為一種支持營養(yǎng)的細(xì)胞，是可以誘導(dǎo)MSC細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的。因此，我們認(rèn)為可能是由于雪旺細(xì)胞在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞周圍起到了神經(jīng)元生存的微環(huán)境作用，或者是支持營養(yǎng)等，以此促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。

綜上所述，雪旺細(xì)胞可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。本研究可望為干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化提供一個較好的方法，為干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的基礎(chǔ)研究提供一個新思路。

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