于 鴻,張 健,劉玉俠,石 虹

(吉林省腫瘤防治研究所,吉林長(zhǎng)春130012)

樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)連接先天和適應(yīng)性免疫。其特點(diǎn)是捕獲抗原和加工,遷移到淋巴器官和表達(dá)抗原特異性淋巴細(xì)胞活化的各種共刺激分子的能力強(qiáng)[1]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞抗腫瘤作用的研究已進(jìn)入了Ⅰ、Ⅱ臨床實(shí)驗(yàn)階段。我們選用臍血為原料誘導(dǎo)擴(kuò)增DCs,使其誘導(dǎo)特異性的T細(xì)胞殺傷活性,殺傷腫瘤細(xì)胞,為DC疫苗臨床應(yīng)用尋找有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 臍血來(lái)源于長(zhǎng)春市婦產(chǎn)醫(yī)院。NCI446、SMMC-7721、K562細(xì)胞株本室常規(guī)傳代培養(yǎng)。IL-2購(gòu)于長(zhǎng)春生物制品研究所。MTT,Sigma進(jìn)口分裝。GM-CSF、IL-4、TNF-α購(gòu)自 MGI MegaGene。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所。RPMI1640購(gòu)于Gibico。胎牛血清購(gòu)自TBD生物技術(shù)發(fā)展中心。3H-TdR購(gòu)于中國(guó)原子能研究所。植物血凝素(PHA)Sigma。IL-12 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳晶美。

1.2 腫瘤抗原的制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化,調(diào)細(xì)胞濃度為1×107/ml,42℃水浴熱休克12 h,37℃恢復(fù)2 h,超聲破膜,高速離心(15 000 rpm,1 h),收獲上清液,用紫外分光光度計(jì)測(cè)蛋白濃度,0.22 um濾器除菌,-80℃分裝凍存。

1.3 DCs的誘導(dǎo) 采用本室自制紅細(xì)胞裂解液分離臍血有核細(xì)胞,獲得的細(xì)胞加于淋巴細(xì)胞分離液上,2 000 rpm離心20 min。取界面細(xì)胞生理鹽水洗2遍,調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/ml,接種于24孔板,每孔1 ml。加入細(xì)胞因子GM-CSF100 ng/ml、IL-4 50 ng/ml、TNF-α 10 ng/ml,37℃、5%CO2條件下 培養(yǎng) 2 周 ,每2天加入細(xì)胞因子1次。第四天時(shí)將細(xì)胞分為2組,一組加入抗原50 μ l/孔,另一組作對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)至第8天,收上清ELISA法測(cè)定IL-12的含量。

1.4 DCs體外刺激T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng) 正常人外周血取自本單位健康志愿者。取抗凝外周血經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心(2 500 rpm,20 min),取界面細(xì)胞用RPMI1640洗滌2遍(1 000 rpm,10 min),制成濃度為3×106/ml的細(xì)胞懸液,加入24孔板,1 ml/孔,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2小時(shí),輕輕洗出懸浮細(xì)胞,注入T細(xì)胞尼龍毛柱,37℃孵育1小時(shí)后,沖洗出非粘附細(xì)胞。調(diào)T細(xì)胞濃度1×106/ml,加入96孔板,100 ul/孔。DC與T細(xì)胞的比例分別為1∶50、1∶20、1∶10,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 96 小時(shí),終止培養(yǎng)前16小時(shí)加入3H-TdR(0.5uci/孔)。液閃測(cè)量。實(shí)驗(yàn)分組①PHA(2.5 ug/孔)②DC+Ag③DC④T細(xì)胞對(duì)照。每組4復(fù)孔。刺激指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組cpm/對(duì)照組cpm

1.5 DCs活化的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

調(diào)靶細(xì)胞濃度為5×104/ml,加入96孔培養(yǎng)板,每孔100 μ l。按效靶比 50∶1加入 DCs活化的 T細(xì)胞,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h,培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT(5mg/ml)20 μ l/孔 ,繼續(xù)培養(yǎng) 4小時(shí),棄上清 ,每孔加入150 μ l DMSO,酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)492 nm處吸光值(A)。實(shí)驗(yàn)分組:①加抗原組②不加抗原組③對(duì)照組。每組4復(fù)孔。

1.6 結(jié)果分析 采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察,臍血細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后第3天細(xì)胞聚集成均勻散布的細(xì)胞聚體,部分細(xì)胞變形,胞體拉長(zhǎng),第7天時(shí)可見(jiàn)不明顯突起,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,第14天時(shí)可見(jiàn)具有典型樹(shù)枝狀突起的樹(shù)突狀細(xì)胞,呈疏松的貼壁生長(zhǎng)或懸浮生長(zhǎng)。負(fù)載抗原組和未負(fù)載抗原組細(xì)胞數(shù)量和外形上沒(méi)有區(qū)別。ELISA測(cè)定結(jié)果表明,抗原負(fù)載的DC IL-12分泌量(37.2±8.6 pg/ml)較未負(fù)載抗原的DC高(21.7±7.4 pg/ml)。

2.2 DCs對(duì)T細(xì)胞的激發(fā)作用見(jiàn)圖1。在組合細(xì)胞因子的作用下,臍血細(xì)胞誘生的DCs可刺激T細(xì)胞增殖,負(fù)載抗原組的DC對(duì)T細(xì)胞的激發(fā)作用較未負(fù)載組強(qiáng)。

圖1 DCs對(duì)T細(xì)胞的激發(fā)作用

2.3 DCs活化的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用見(jiàn)圖2。DCs激活后的T細(xì)胞分別與三種靶細(xì)胞作用,都產(chǎn)生了明顯的殺傷作用。說(shuō)明這種非特異性的抗腫瘤活性有趨于廣譜的特點(diǎn)。

圖2 DC激發(fā)的臍血有核細(xì)胞的體外腫瘤殺傷效應(yīng)(±s,n=4)

3 討論

抗腫瘤的主要效應(yīng)細(xì)胞是 CD8+T細(xì)胞。當(dāng)DCs遇到促炎性刺激,如細(xì)菌產(chǎn)物,就開(kāi)始了成熟過(guò)程,導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子分泌及MHC分子和共刺激分子表達(dá)上調(diào)。伴隨著成熟和歸巢到LNs,DCs通過(guò)形成免疫突觸與T細(xì)胞建立聯(lián)系,那里的TCR/MHC相互作用,共刺激分子聚集在圍繞著粘附分子的中心地區(qū)。一旦被激活,CD8+CTLs就會(huì)擴(kuò)增數(shù)代,并獲得細(xì)胞溶解酶的功能。目前DCs疫苗已被看作是一種最有前途的腫瘤疫苗[2]。1986年Srivastava第一次明確提出從腫瘤細(xì)胞中提取的HSP-肽復(fù)合物具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,而且這種作用非常特異。隨后Srivastava所做的大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)HSP-肽復(fù)合物的免疫原性來(lái)源于腫瘤肽而非HSP本身。HSP可能作為腫瘤肽分子的載體參與MHCⅠ類分子介導(dǎo)的抗原加工途徑,激活CD8+T細(xì)胞或是作為γ δ T細(xì)胞識(shí)別的抗原配體,通過(guò)MHCⅡ和非MHC介導(dǎo)途徑,激發(fā)CTL介導(dǎo)免疫應(yīng)答[3]。

本實(shí)驗(yàn)中,我們用自制的紅細(xì)胞裂解液分離臍血有核細(xì)胞,成本低、操作簡(jiǎn)便、污染機(jī)會(huì)少。經(jīng)GM-CSF、IL-4、TNF-α聯(lián)合培養(yǎng)后,可生成大量的DC。HSP-肽復(fù)合物刺激的DC體外可強(qiáng)烈激發(fā)T細(xì)胞增殖,DC激發(fā)的T細(xì)胞分別與三種靶細(xì)胞作用,都產(chǎn)生了明顯的殺傷作用。DCs在接觸了腫瘤抗原后,其分泌IL-12的能力增強(qiáng)了,IL-12可以增加NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和INF-γ的產(chǎn)生,從而使機(jī)體維持一定的針對(duì)腫瘤細(xì)胞的非特異性免疫應(yīng)答能力。

以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗是目前刺激抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的最有效的方法,臨床實(shí)驗(yàn)表明DC疫苗用于手術(shù)或放療、化療后仍有殘存微小病灶的病人,能被很好的耐受,并能在體內(nèi)介導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。DC疫苗在惡性腫瘤治療中的前景巨大,用于人體安全有效的DC疫苗必將取得更多的突破。

[1]Banchereau J,Pascual V,Palucka AK.Autoimmunity through cytokine-induced dendritic cell activation[J].Immunity,2004,20(5):539.

[2]Triazzi PL,Khurram R,Aldrich WA,et al.Intratumoral injection of dendritic cells derived in vitro in patients with metastatic cancer[J].Cancer,2000,89(12):2646.

[3]孟凡東,楊春明,陳 冬,等.人腎癌組織中熱休克蛋白7O的純化與鑒定分析[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2006,l6(5):672.