張朝華 ，趙春利

(1.河北大學醫(yī)學部2007級碩士研究生，河北 保定 071000;2.河北省保定市第一醫(yī)院，河北 保定 071000;3.河北大學附屬醫(yī)院泌尿外科，河北 保定 071000)

Treg細胞(CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞)是一類可抑制免疫反應(yīng)、維持機體免疫狀態(tài)穩(wěn)定的T淋巴細胞亞群[1－2]。Treg細胞可抑制CD4+和CD8+T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，已有大量研究顯示，Treg細胞在抑制同種異體器官移植的排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病及自身免疫性疾病的發(fā)病機制中起著重要作用[3]。在腫瘤患者及腫瘤動物模型中，均發(fā)現(xiàn)Treg細胞可負性調(diào)節(jié)機體抗腫瘤免疫反應(yīng)，引起荷瘤機體T淋巴細胞功能障礙[4]。近年來，在結(jié)直腸癌、膽囊癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌等實體腫瘤患者體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了Treg細胞百分率顯著增多[5－8]。目前，關(guān)于Treg細胞誘導(dǎo)機體產(chǎn)生腫瘤免疫耐受狀態(tài)的具體機制仍未明確，且有關(guān)其在泌尿系腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與臨床分期、預(yù)后等相關(guān)性的研究較其他腫瘤明顯偏少。為此，本研究綜合分析了Treg細胞與腎癌患者臨床預(yù)后間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

病例資料與標本:實驗組為河北大學附屬醫(yī)院和保定市第一醫(yī)院2007年7月至9月收治的30例腎癌患者，均接受根治性手術(shù)，腫瘤標本直接從手術(shù)切除標本上獲取。其中男14例，女16例，年齡19～70歲，中位年齡54歲;因健康體檢發(fā)現(xiàn)者9例，以血尿為主要癥狀者8例，腰酸8例，腹痛5例;Robson分期為Ⅰ期9例，Ⅱ期12例，Ⅲ期5例，Ⅳ期4例;術(shù)后病理檢查示透明細胞癌9例，顆粒細胞癌2例，混合細胞癌6例，嫌色細胞癌7例，其他病理類型6例。

儀器與試藥:EPLCS2 XL型流式細胞儀(美國Beckman Coulter Cytomics公司)。三色熒光標記的T淋巴細胞亞群檢測試劑盒及anti－CD4－異硫氰酸熒光素(FITC)/anti－CD25－異藻青蛋白(APC)/anti－Foxp3－藻紅蛋白(PE)，同型陰性對照為 IgG1－FITC/IgG1－APC/IgG1－PE，甲酸溶血劑(美國 Beckman Coulter公司);真空采血管，內(nèi)加EDTA－K2抗凝劑。

1.2 方法

組織細胞處理方法:術(shù)中切取腫瘤中心部位組織，將其剪碎，制成直徑約1 mm的組織塊。經(jīng)400目篩網(wǎng)研磨后以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗、懸浮，以2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后棄去上清液，重復(fù)操作兩次后以顯微鏡計數(shù)。以PBS充分洗滌后重懸，制成每100 μL懸液中含106個細胞的單細胞懸液。加入FITC標記的鼠抗人CD4抗體、APC標記的鼠抗人CD25抗體，4℃避光孵育30 min后以PBS洗滌2次，加入1 mL紅細胞裂解液裂解2 min，充分洗滌后加入新鮮配制的破膜液1 mL，4℃避光孵育60 min后加破膜緩沖液洗滌，加入正常鼠血清封閉抗體15 min，再加入PE標記的Foxp3抗體，4℃避光孵育30 min后上流式細胞儀檢測。測定每份標本的10 000個淋巴細胞中Treg細胞的百分率。

外周血細胞處理方法:分別于手術(shù)前及免疫治療前后無菌采血2 mL。用等量PBS混勻后，按1∶1的體積比將外周血稀釋液沿試管壁緩緩加入淋巴細胞分離液上層，常溫離心(2 000 r/min)30 min。用移液管緩慢均勻吸出紅細胞層與血清分離液層中間的單個核細胞(PBMC)層，輕輕地將吸出灰白色的PBMC分別置離心管，再次用PBS洗滌兩次，離心棄去上清液。于離心管中加入FITC標記的鼠抗人CD4/異藻青蛋白(APC)標記的鼠抗人CD25抗體，4℃避光30 min后PBS洗滌，加入新鮮配制的專用破膜劑1 mL，4℃避光60 min后破膜劑緩沖液洗滌，加入正常鼠血清封閉抗體15 min，加入藻紅蛋白(PE)標記的Foxp3單克隆抗體，4℃避光30 min后破膜劑緩沖液洗滌，制成標準樣品上機檢測，觀察Treg細胞水平。

隨訪:手術(shù)前與患者充分溝通，確定術(shù)后隨訪方案。所有患者均從出院后開始隨訪，主要采用門診隨訪、電話隨訪及網(wǎng)絡(luò)隨訪相結(jié)合的方式。術(shù)后第1年隨訪間隔時間為3個月，復(fù)查項目包括腹部CT及B型超聲、腫瘤標志物等。術(shù)后第2年、第3年隨訪間隔時間為6個月。隨訪終點設(shè)定為患者死亡或生存期滿36個月。

1.3 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件，兩組比較采用Wilcoxon秩和檢驗，單因素生存分析采用Kaplan－Meier法，組間比較采用Log－rank檢驗。以36個月為截尾時間，非腫瘤相關(guān)性死亡為散失。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

30例患者隨訪至2010年7月，隨訪時間16～41月，失訪2人，失訪率為6.67%?；颊呖偵鏁r間平均29.0月(95%可信區(qū)間為 24.5－33.5)，無復(fù)發(fā)生存時間平均 23.7月(95%可信區(qū)間為 19.9 －27.2)。

30例患者外周血Treg細胞百分率平均值為(2.24±0.35)%，故以2.24%為標準將患者分為Treg細胞高水平組(＞2.24%)和低水平組(≤2.24%);患者腫瘤組織內(nèi)Treg細胞百分率平均值為0.091%，故以0.091%為標準將患者分為Treg細胞高水平組(＞0.091%)和低水平組(≤0.091%)?；颊呱鏁r間與外周血及腫瘤組織內(nèi)Treg細胞百分率、腫瘤分期的相關(guān)性分析見表1?？梢?，患者生存時間與外周血Treg細胞百分率顯著相關(guān)，與腫瘤組織內(nèi)Treg細胞百分率不相關(guān)，與腫瘤Robson分期密切相關(guān)，與病理類型則無顯著相關(guān)性。

3 討論

TNM分期標準中，僅通過腫瘤原發(fā)灶直徑和腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目等來判斷局限性腎癌與進展期腎癌的預(yù)后。從最終的臨床效果來看，單純憑影像學檢查及現(xiàn)有病理學分級標準無法準確判斷患者預(yù)后，使部分患者失去了早期干預(yù)治療的機會。因此，期望能找到更加合理有效的臨床預(yù)后指標，用以早期提示高?；颊撸踔令A(yù)測術(shù)后相關(guān)治療的臨床療效。

表1 患者生存時間的相關(guān)因素分析

Treg細胞在腫瘤免疫中的作用是目前的研究熱點之一，現(xiàn)已在肺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等腫瘤患者全身以及腫瘤微環(huán)境進行了大量研究。Sasada等[9]檢測了局限性進展期胃癌患者及遠處轉(zhuǎn)移的胃癌患者外周血中Treg細胞的百分率及表型，與健康志愿者相比，胃癌患者外周血中Treg細胞百分率較高，已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移患者更高;Treg細胞百分率與腫瘤預(yù)后明顯相關(guān)，隨著Treg細胞百分率的升高，患者預(yù)后越差。Ormandy等[10]則發(fā)現(xiàn)，肝癌患者外周血及腫瘤組織內(nèi)Treg細胞百分率較正常人均明顯升高，且慢性病毒性肝炎患者處于疾病活動期時外周血中的Treg細胞水平也較恢復(fù)期時明顯升高。近年來積累的大量研究結(jié)果顯示，機體是通過Treg細胞的主動免疫抑制作用來維持自身免疫耐受，包括下調(diào)效應(yīng)性T細胞對自身抗原和外來抗原的應(yīng)答反應(yīng)等機制，從而起到負性免疫調(diào)節(jié)作用;但與此同時，這也減弱了機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視功能，增加了腫瘤細胞的免疫逃逸概率，使腫瘤細胞不僅不易被早期識別、殺滅，而且更易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移。這一理論可以部分解釋機體對腫瘤抗原弱反應(yīng)性的原因。

本研究在測定了腎癌患者外周血及腫瘤組織中Treg細胞百分率的基礎(chǔ)上，進一步研究了其與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系。單因素分析結(jié)果顯示，腎癌患者總生存時間和無復(fù)發(fā)生存時間與外周血中Treg細胞百分率顯著相關(guān)，水平較高者術(shù)后復(fù)發(fā)時間較早，總生存時間也較短，說明外周血中Treg細胞百分率可以作為提示腎癌患者預(yù)后的指標之一;腫瘤組織內(nèi)的Treg細胞百分率與總生存時間和無復(fù)發(fā)生存時間都無顯著相關(guān)性，說明這一指標對腎癌預(yù)后的影響仍不明確，尚需進一步研究。

由于腎癌的手術(shù)治療效果目前仍不理想，因此近年來醫(yī)學界更加重視術(shù)前篩選預(yù)后較差的高危患者，術(shù)后早期進行有效的抗腫瘤免疫治療，而如何篩選及預(yù)測哪些患者對何種抗腫瘤免疫治療方案更加敏感是目前腎癌研究的重要內(nèi)容。本研究證實，外周血中Treg細胞水平可作為預(yù)測腎癌預(yù)后的指標之一，而腫瘤組織內(nèi)的Treg細胞百分率水平則無法腎癌預(yù)后。因此，術(shù)前檢測腎癌患者外周血中Treg細胞百分率，有助于篩選高危患者亞群，從而在術(shù)后早期給予適當?shù)目鼓[瘤免疫治療，改善腎癌的綜合治療效果。

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