呂建強(qiáng),何云蔚,盧體康,花群義,秦智鋒,陶 虹,楊俊興,阮周曦

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東深圳 518010;2.創(chuàng)世紀(jì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)有限公司,廣東深圳 518048)

偽狂犬病病毒實(shí)時熒光PCR的建立和應(yīng)用*

呂建強(qiáng)1,何云蔚2,盧體康1,花群義1,秦智鋒1,陶 虹1,楊俊興1,阮周曦1

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東深圳 518010;2.創(chuàng)世紀(jì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)有限公司,廣東深圳 518048)

偽狂犬病是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要動物疫病,快速檢測是有效防控該病的重要措施之一。為了建立該病的快速分子生物學(xué)檢測方法,根據(jù)GenBank中登錄的偽狂犬病病毒gD基因序列,選擇高度保守區(qū)域設(shè)計引物和TaqMan熒光探針,通過對實(shí)時熒光PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了用于檢測偽狂犬病病毒的實(shí)時熒光PCR方法。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明,該檢測方法只能檢測到目的病毒,表明其具有良好的特異性。靈敏性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),其最低檢測限可達(dá)1.42 pg/μ L的總DNA,與PCR方法的靈敏度對比試驗(yàn)表明,其敏感度比PCR至少高10倍。對同一樣品進(jìn)行重復(fù)性檢測,在組內(nèi)及組間檢測的熒光擴(kuò)增曲線基本重疊,證實(shí)其重復(fù)性好。對180份臨床樣品進(jìn)行偽狂犬病病毒核酸檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有52份陽性樣品。結(jié)果表明,所建立的實(shí)時熒光PCR方法可對偽狂犬病病毒進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的檢測,具有特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),是開展偽狂犬病的臨床檢測和疫情監(jiān)測工作的有力工具。

偽狂犬病病毒;實(shí)時熒光PCR;檢測

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科,可以感染多種家畜和野生動物,除豬以外的動物發(fā)病通常具有發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎等典型癥狀,均為致死性感染。豬是PRV的天然宿主、貯存者和傳播源,其感染后主要表現(xiàn)為母豬發(fā)生繁殖障礙,仔豬大量死亡,公豬感染后失去種用能力,成年豬感染則表現(xiàn)為增重緩慢[1-2]。

目前,國內(nèi)外對該病進(jìn)行了廣泛深入的研究,研制了有效的疫苗用于防控及凈化該病[3],同時也建立了多種診斷方法,包括區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動物的抗體鑒別診斷方法。在血清學(xué)檢測方面,有多種方法在實(shí)際工作中普遍應(yīng)用,尤其是鑒別診斷ELISA可以區(qū)分免疫和感染動物,是實(shí)施根除計劃的必備工具[4-6]。在病原檢測方面有病毒分離鑒定、免疫熒光抗體染色技術(shù)、雙抗夾心 ELISA、核酸探針和PCR等檢測方法,其中PCR檢測方法準(zhǔn)確、簡便、快速,在臨床檢測中得到廣泛應(yīng)用[7-10]。但是PCR檢測中涉及擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析,容易形成氣溶膠而污染檢測環(huán)境,使隨后的檢測出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。為了克服PCR方法的不足、提高檢測敏感性,本研究采用TaqMan熒光探針技術(shù),建立檢測PRV的實(shí)時熒光PCR方法,其特異性更強(qiáng),敏感性至少比普通PCR高10倍,檢測周期更短、重復(fù)性好,可以應(yīng)用于臨床檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細(xì)胞 2株偽狂犬病病毒GD0402、GD0603均由廣東某養(yǎng)殖場病豬中分離獲得,由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存;PK-15細(xì)胞由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器和試劑 ABI 7500實(shí)時熒光PCR儀;MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、ExTaq酶、DNA Marker DL 2 000均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 臨床送檢樣品 來自于深圳注冊豬場送檢的180份臨床樣品,樣品包括豬鼻腔拭子、病豬腦組織、淋巴結(jié)等,研磨制備組織懸液(體積比1∶5)用于PRV熒光PCR檢測。

1.2 方法

1.2.1 引物、探針的設(shè)計與合成 根據(jù)已報道的偽狂犬病病毒核酸序列,經(jīng)同源性分析比較后,選擇gD基因中高度保守的特異區(qū)段來設(shè)計熒光PCR的引物和TaqMan探針,并由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成、標(biāo)記,上游引物序列為:5′-CGCACCTGCTGTACT TTATCG-3′,下 游 引 物 序 列 為:5′-AGCGCCCAAAGATCTGC-3′, 熒 光 素 標(biāo) 記TaqMan 探 針 序 列 為:5′-FAM-TACGCCGACTGCGACCCCA-3′。

普通PCR采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18641-2002中的檢測引物,上游引物序列為 5′-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3′,下 游 引 物 序 列 為 5′-GTCCACGCCCCGCT TGAAGCT-3′,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,用于擴(kuò)增PRV的核酸片段,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為217 bp。

1.2.2 病毒滴度的測定 按照文獻(xiàn)[11]中的方法,測定、計算偽狂犬病病毒的TCID50。

1.2.3 病毒核酸的提取 參照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit的說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 PRV普通PCR檢測 參照文獻(xiàn)[12]中的PCR方法進(jìn)行。

1.2.5 PRV實(shí)時熒光PCR檢測方法的建立和條件優(yōu)化 PRV熒光PCR的反應(yīng)體系參照ExTaq酶的說明書配制,采用50 μ L反應(yīng)體系,將上游引物、下游引物和熒光探針同時加入到反應(yīng)體系中,于ABI 7500熒光PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。對熒光PCR反應(yīng)體系中引物和探針濃度進(jìn)行系列梯度方陣測定法篩選,以獲得最低Ct值、典型熒光擴(kuò)增曲線和較高熒光強(qiáng)度增加值(ΔRn)的引物和探針最佳濃度。

1.2.6 PRV實(shí)時熒光PCR的特異性試驗(yàn) 選取豬細(xì)小病毒、豬腺病毒、豬圓環(huán)病毒及2株P(guān)RV分離株,分別提取核酸作為模板進(jìn)行PRV熒光PCR檢測,觀察結(jié)果確定該方法的特異性。

1.2.7 PRV實(shí)時熒光PCR與普通PCR靈敏度比較 取 TCID50為 106.3的 PRV 病毒液 100 μ L,按1.2.2中的方法提取病毒DNA,測定核酸濃度后,作7個10倍系列稀釋,以每個稀釋度的核酸作為模板同時進(jìn)行PRV的熒光PCR與普通PCR檢測。

1.2.8 PRV實(shí)時熒光PCR的重復(fù)性試驗(yàn) 對同一陽性樣品的4個不同稀釋度進(jìn)行 4個重復(fù)的PRV熒光PCR檢測,通過組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)的熒光擴(kuò)增曲線及Ct值變化來評估該方法的重復(fù)性。

1.2.9 PRV實(shí)時熒光PCR的臨床檢測 利用本研究建立的PRV熒光PCR檢測方法,對臨床送檢的180份樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 PRV實(shí)時熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

選用終濃度為 0.1、0.2 、0.4、0.6 、0.8 μ mol/L的引物和0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μ mol/L 的探針 ,采用方陣法檢測篩選引物和探針的最佳反應(yīng)濃度。試驗(yàn)結(jié)果表明,采用0.6 μ mol/L的引物和 0.2 μ mol/L的探針終濃度,檢測獲得的Ct值最小、熒光擴(kuò)增曲線最典型而ΔRn值較大,從而確定其為最佳引物和探針濃度。

優(yōu)化后的反應(yīng)程序如下:95℃5 min;95℃、15 s,49 ℃、32 s,72 ℃、15 s,重復(fù)40個循環(huán),設(shè)置每個循環(huán)的退火階段收集熒光信號。

2.2 PRV實(shí)時熒光PCR方法的特異性

用建立的PRV熒光PCR方法對豬細(xì)小病毒、豬腺病毒、豬圓環(huán)病毒3種廣泛分布的豬DNA病毒及2株P(guān)RV分離株進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有對2株P(guān)RV分離株的檢測出現(xiàn)了陽性擴(kuò)增曲線,而對其他病毒的檢測為陰性(圖1),表明該 PRV實(shí)時熒光PCR檢測方法的特異性很好。

圖1 PRV實(shí)時熒光PCR的特異性檢測Fig.1 Specificity test for detection of PRV by real-time PCR

2.3 PRV實(shí)時熒光PCR與普通PCR的靈敏度比較試驗(yàn)

取TCID50為106.3的 PRV 病毒液 100 μ L提取總DNA,Genequant Pro型核酸計數(shù)儀測定其核酸質(zhì)量濃度為142 ng/μ L。將DNA進(jìn)行10倍系列稀釋(10-1～10-7),分別同時進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)和普通PCR反應(yīng),結(jié)果熒光PCR可以檢測的最低稀釋度為 10-6(圖 2),相當(dāng)于濃度為 1.42 pg/μ L的DNA(對應(yīng)約3 TCID50的病毒量),稀釋度為10-7時檢測結(jié)果為可疑,而普通PCR法在10-5稀釋度時可以觀察到217 bp的目的條帶,但是10-6稀釋度時為陰性結(jié)果(圖3),檢測結(jié)果的對比情況見表1。表明本研究建立的熒光PCR檢測PRV的靈敏度比普通PCR至少高出約10倍。

圖2 PRV實(shí)時熒光PCR檢測方法的靈敏度試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity test fo r detection of PRV by real-time PCR

圖3 PRV普通PCR檢測方法的靈敏度試驗(yàn) Fig.3 Sensitivity test for detection of PRV by routine PCR

2.4 PRV實(shí)時熒光PCR重復(fù)性試驗(yàn)

對同一陽性樣品的4個不同稀釋度分別進(jìn)行4個重復(fù)的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),陰性對照沒有Ct值,而樣品同一稀釋度內(nèi)4個平行樣的擴(kuò)增曲線在閾值線附近基本重合(圖4),各稀釋度的4個重復(fù)檢測結(jié)果Ct值變化范圍分別為 0.03、0.51、0.36、0.38,表明本研究所建立的PRV熒光PCR檢測方法重復(fù)性好,完全可以進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的檢測。

表1 實(shí)時熒光PCR與普通PCR檢測靈敏度的比較Table 1 Sensitivity comparison between real-time PCR and routine PCR

圖4 PRV實(shí)時熒光PCR的重復(fù)性試驗(yàn)Fig.4 Repeatability test of P RV real-time PCR

2.5 實(shí)時熒光PCR方法的臨床檢測

取臨床送檢的180份樣品進(jìn)行PRV實(shí)時熒光PCR檢測,檢測到52份樣品出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線,Ct值均在30以下,表明有PRV的感染,其余樣品均為陰性,該檢測結(jié)果與普通PCR檢測結(jié)果完全一致,與樣品來源豬的血清抗體gE鑒別ELISA檢測結(jié)果也間接符合。

3 討論

經(jīng)過國內(nèi)外學(xué)者的廣泛深入研究,對偽狂犬病的防控已經(jīng)取得巨大突破,研制的基因缺失標(biāo)記疫苗配合鑒別診斷ELISA方法,可以進(jìn)行該病的根除計劃,并且在一些發(fā)達(dá)國家獲得了成功。與此同時,在該病的核酸檢測方法研制方面也取得了進(jìn)展,PCR技術(shù)已逐漸應(yīng)用到偽狂犬病的診斷中,這些診斷技術(shù)簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏,是較病毒分離更加便捷易行的診斷方法,其已廣泛用于病毒病的早期診斷。隨著PCR診斷方法的廣泛應(yīng)用,研究者發(fā)現(xiàn)該方法存在一些不足,甚至影響其推廣應(yīng)用。

為了克服偽狂犬病病毒PCR檢測方法的不足,本研究采用熒光TaqMan探針技術(shù)來研制偽狂犬病病毒實(shí)時熒光PCR檢測方法。該方法的檢測結(jié)果無需電泳檢測、不使用溴化乙錠,保障了實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境的安全;避免了電泳開蓋時出現(xiàn)氣溶膠污染的現(xiàn)象,保證監(jiān)測結(jié)果的可靠性;在檢測周期上要比普通PCR縮短2 h～3 h,從核酸的提取到熒光PCR反應(yīng)完成只需要4 h,且可以在線觀察檢測情況,大大提高了檢測效率,特別適合大規(guī)模樣品的快速檢測以及緊急疫情的快速診斷[13-15]。

本研究所用的引物和探針是根據(jù)GenBank中已報道的偽狂犬病病毒gD基因序列中保守區(qū)域設(shè)計的。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),所建立的實(shí)時熒光PCR方法特異性強(qiáng),只能檢測到目標(biāo)毒株,對豬細(xì)小病毒、豬腺病毒、豬圓環(huán)病毒3種廣泛分布的豬DNA病毒擴(kuò)增反應(yīng)陰性,其靈敏度可達(dá)到1.42 pg/μ L的總核酸(對應(yīng)約3 TCID50的病毒量),比普通PCR方法的靈敏度至少高10倍。重復(fù)性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),對同一樣品在組內(nèi)及組間的檢測結(jié)果Ct值變化范圍小于0.51,表明其具有良好的重復(fù)性及實(shí)用性。利用本方法及普通PCR檢測180份臨床樣品,結(jié)果有52份樣品呈陽性檢測結(jié)果,兩者檢測結(jié)果完全一致,并且與對樣品來源動物進(jìn)行全病毒ELISA抗體檢測結(jié)果間接相符。本研究建立的實(shí)時熒光PCR檢測方法將為偽狂犬病的流行病學(xué)調(diào)查提供了有力的工具,非常適合于基層防疫部門及口岸動植物檢疫部門推廣應(yīng)用。此外,由于該方法可以檢測到組織中極微量的病毒DNA,且可以進(jìn)行定量檢測,這將為研究病毒的入侵途徑、研究其嗜好組織、在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖過程、在體內(nèi)的動態(tài)分布以及潛伏和復(fù)發(fā)機(jī)制等提供有力工具,從而有利于進(jìn)一步闡明偽狂犬病病毒的傳播和致病機(jī)理。

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Development and Application of a Real-time Fluorescence PCR Assay for Pseudorabies Virus

(1.Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shenzhen,Guangdong,518010,China;2.Biocentury Transgene(China)Co.,Ltd,Shenzhen,Guangdong,518048,China)

Pseudorabies(PR)has already become an important animal disease all over the world,which affects badly on pig production.Rapid,accurate detection is one of main measure to prevent the disease.In order to develop a rapid molecular detection method,this study designed a pair of primers and aTaqMan fluorescence probe based on the gD gene of pseudorabies virus(PRV).The sequence was reported in Gen-Bank.After optimizing reaction condition of the real-time fluorescence PCR,a real-time fluorescence PCR assay was developed to detect PRV.The results indicated that specificity,sensitivity and reproducibility of the developed method were all high.180 clinical samples were detected by real-time fluorescence PCR assay for pseudorabies virus.52 samples were positive,and others were negative.The study demonstrated that the real-time fluorescence PCR assay developed for pseudorabies virus could be used for clinical test and inspection as a powerful tool.

Pseudorabies virus;real-time PCR;detection

S852.659.1;S854.43

A

1007-5038(2010)03-0021-05

2009-10-28

檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目(2007B008);深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目(SZK33-2005)

呂建強(qiáng)(1975-),男,內(nèi)蒙古巴彥淖爾人,高級獸醫(yī)師,博士研究生,主要從事動物檢疫及動物病毒學(xué)研究。