郭 娟,王志琴,趙云程,林嘉鵬,黃俊成*

(1.新疆畜牧科學院農(nóng)業(yè)部家畜繁育生物技術(shù)重點開放實驗室,新疆烏魯木齊 830000;2.新疆農(nóng)業(yè)大學動醫(yī)學院,新疆烏魯木齊 830052)

細胞松弛素B對玻璃化冷凍牛卵母細胞的影響*

郭 娟1,2,王志琴2,趙云程1,林嘉鵬1,黃俊成1*

(1.新疆畜牧科學院農(nóng)業(yè)部家畜繁育生物技術(shù)重點開放實驗室,新疆烏魯木齊 830000;2.新疆農(nóng)業(yè)大學動醫(yī)學院,新疆烏魯木齊 830052)

用不同濃度細胞松弛素B(CB)預處理體外成熟牛卵母細胞,以固體表面玻璃化(SSV)法冷凍解凍后的存活率和孤雌激活發(fā)育能力作為評價指標,探討CB對體外成熟牛卵母細胞冷凍保存的影響。結(jié)果顯示,存活率方面,各濃度CB處理組與對照組無顯著差異(P＞0.05);激活后卵裂率方面,20 μ g/mL CB處理組顯著高于對照組(47.67%和30.25%,P＜0.05);囊胚率方面,20 μ g/mL CB處理組極顯著高于對照組(9.00%和1.75%,P≤0.01),同時還顯著高于其他4個處理組(P＜0.05)。研究表明,CB在玻璃化冷凍過程中的保護作用存在一定濃度的依賴性,其中用20 μ g/mL CB濃度處理最適于牛成熟卵母細胞玻璃化冷凍效果的改善。

卵母細胞;玻璃化冷凍;牛;細胞松弛素B

隨著胚胎工程技術(shù)逐步應用于家畜繁殖和育種領域并形成產(chǎn)業(yè)化,卵母細胞的來源是制約其發(fā)展的重要因素,卵母細胞超低溫冷凍保存則是把這些技術(shù)發(fā)展到應用階段不可缺少的一個重要技術(shù)手段。

自1985年Rall W F等[1]首次應用玻璃化法對小鼠胚胎冷凍保存成功以來,由于其比傳統(tǒng)程序化冷凍方法具有無需儀器設備、操作簡便省時、適用范圍廣和冷凍效果好等優(yōu)點,便很快應用于卵母細胞冷凍保存的研究中。但高濃度的玻璃化液也會對卵母細胞造成嚴重損傷,影響冷凍效果,于是人們通過尋找容易實現(xiàn)玻璃化并且對卵母細胞損傷較小的玻璃化液,以及大幅度提高冷凍速率而進一步減少冷凍對卵母細胞的損害。在此期間,多種玻璃化冷凍方法應運而生,如開放式拉長塑料細管法(open pulled straw,OPS)、固體表面玻璃化法(solid surface vitrification,SSV)和玻璃微細管法(glass micropipette,GMP)等都取得了一定的冷凍保護效果。目前,僅小鼠成熟卵母細胞的冷凍保存技術(shù)已趨為完善。家畜中,雖然牛卵母細胞冷凍保存研究最多,但只獲得了極少數(shù)來自冷凍牛GV期[2]和體外成熟卵母細胞[3]的牛犢,其冷凍卵母細胞的成熟率、受精率和發(fā)育率與未冷凍卵母細胞相比都還很低。

細胞松弛素B(cytochalasin-B,CB)是一種細胞骨架穩(wěn)定劑,能增加細胞骨架的彈性,降低卵母細胞和胚胎在凍融過程中由于細胞骨架變硬而引起的骨架變形和損傷[4-6]。CB在卵母細胞玻璃化冷凍過程中應用的報道還比較少,國外在豬卵母細胞上的研究較多,指出其對豬卵母細胞具有一定的影響作用。但在更有經(jīng)濟價值的牛卵母細胞上,目前國內(nèi)外僅見Vieira A D等[7]和卞桂華等[8]的報道。為此,本試驗開展了CB預處理對牛成熟卵母細胞SSV玻璃化冷凍效果的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

卵巢采自新疆烏魯木齊市天鷹屠宰場,精液是由新疆維吾爾自治區(qū)畜禽改良總站提供的細管凍精。所用試劑除TCM199(Gbico),FBS(Hyclone),BSA(Bovogen)和 MEN NEAA(Gbico)外,其余均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞的采集和成熟培養(yǎng) 從屠宰場收集成年母牛的卵巢,放入裝有30℃～35℃滅菌生理鹽水(含青、鏈霉素各100單位/mL)的保溫瓶中,2 h內(nèi)帶回實驗室。卵巢用38.5℃滅菌生理鹽水沖洗3次,用10 mL一次性注射器從卵巢表面上直徑為2 mm～8 mm卵泡內(nèi)抽取卵母細胞。在體視鏡下挑出卵丘細胞完整、卵母細胞胞質(zhì)均勻的卵丘-卵母細胞復合體(COCs),先用洗卵液(Hepes-M199+1 mg/mL PVA+雙抗)清洗2遍,再用成熟培養(yǎng)液(TCMI99+100 mL/L FBS+0.05 IU/mL FSH+0.05 IU/mL LH+1 μ g/mL E2)洗 3 次,最后將 50枚COCs吸入含0.5 mL成熟液的四孔培養(yǎng)板中,置38.5℃含體積分數(shù)為5%的CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。洗卵液、成熟液均預先在CO2培養(yǎng)箱平衡約2 h。

1.2.2 玻璃化冷凍程序 本試驗采用SSV法進行玻璃化冷凍[9]。所有步驟在39℃下進行,具體方法如下:卵母細胞去掉部分卵丘細胞,置于基礎冷凍液(HM)中 20 min(基礎冷凍液由 Hepes-M199和200 mL/L FBS組成);將5枚～6枚卵母細胞置于含100 mL/L二甲基亞砜(DMSO)+100 mL/L乙二醇(EG)的 HM 液(VS1)中 1 min,移入含有200 mL/L DMSO+200 mL/L EG的HM液(VS2)中,在30 s內(nèi),將含有5枚～6枚卵母細胞和1 μ L～2 μ L的VS 2滴入提前浸入液氮的金屬表面上,迅速冷凍,用鑷子將冷凍的卵母細胞移入凍存管中,凍存于液氮中(1 d或1個月)。

圖1 牛MⅡ卵母細胞解凍后胞質(zhì)萎縮(100×)Fig.1 Ooplasm atrophy of bovine MⅡoocytes after thawing(100×)

解凍時將冷凍的卵母細胞在含0.25 mol/L蔗糖的HM液中停留1 min,然后移入含0.15 mol/L蔗糖的HM液中停留5 min。

1.2.3 復蘇后卵母細胞存活評定 凍融后的卵母細胞在成熟液中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,觀察其存活情況。存活的卵母細胞與未經(jīng)冷凍的卵母細胞在形態(tài)上沒有差別,如有完整透明帶和細胞膜,且胞質(zhì)折光性好則判定為存活;如透明帶破裂、脫落、細胞質(zhì)碎裂、細胞萎縮均視為異常(圖1～圖4)。

圖2 牛MⅡ卵母細胞解凍后透明帶破損(200×)Fig.2 Zona pellucide of disrepair bovine MⅡoocytes after thawing(200×)

圖3 牛MⅡ卵母細胞解凍后胞質(zhì)溢出(100×)Fig.3 Ooplasm spill bovine MⅡoocytes after thawing(100×)

圖4 解凍后形態(tài)正常牛MⅡ卵母細胞(100×)Fig.4 Morphologically normal bovine MⅡoocytes after hawing(100×)

1.2.4 卵母細胞的孤雌激活 成熟卵母細胞用5 mg/L透明質(zhì)酸酶消化卵丘-卵母細胞復合體,得到裸卵 ,放入離子霉素(5 μ mol/L)中處理 5 min,然后移入已平衡好2 mmol/L 6-DMAP液中,在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

1.2.5 胚胎體外培養(yǎng) 孤雌激活后的卵母細胞移入SOFaa培養(yǎng)液(50 μ L/滴,20 ～25枚/滴),置培養(yǎng)箱中進行體外發(fā)育培養(yǎng)。于激活后48 h后統(tǒng)計卵裂率,并換SOFaa+100 mL/L FBS共培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至第7天～第 8天統(tǒng)計囊胚率(圖5,圖6)。

圖5 牛MⅡ卵母細胞解凍后孤雌激活胚胎(100×)Fig.5 Embryo from vitrified-thawed bovine MⅡoocytes after activation(100×)

圖6 牛M Ⅱ卵母細胞解凍后孤雌激活囊胚(100×)Fig.6 Blastocyst from vitrified-thawed bovine MⅡoocytes after activation(100×)

1.2.6 統(tǒng)計分析 試驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進行差異顯著性統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度細胞松弛素B預處理對牛成熟卵母細胞冷凍后存活率的影響

CB預處理濃度分別為 2.5、7.5、10、20 和30 μ g/mL。將挑選的卵母細胞隨機分為6組,第 1組卵母細胞直接冷凍作為對照組(即0組),其余5組用不同濃度CB處理30 min后,按照SSV玻璃化冷凍的方法處理卵母細胞,試驗結(jié)果見表1。從所示數(shù)據(jù)可以看出,20 μ g/mL CB組的存活率相對較高,但經(jīng)過統(tǒng)計分析表明,5個處理組的存活率與對照組之間都無顯著差異(P＞0.05)。這表明試驗中所用各濃度CB均對玻璃化冷凍的牛成熟卵母細胞存活沒有明顯的改善作用和毒副作用。

表1 不同濃度CB對牛成熟卵母細胞玻璃化冷凍存活率的影響(n=3)Table 1 Effects of survival rate of vitrified bovine matured oocytes treated with CB in different concentrations

2.2 不同濃度細胞松弛素B預處理對牛成熟卵母細胞冷凍后孤雌激活后期發(fā)育能力的影響

凍融后用離子霉素和6-DMAP進行化學激活(表2)。可以看出,在卵裂率方面,5個處理組中20 μ g/mL CB組的卵裂率顯著高于對照組(P＜0.05),且它與 10 μ g/mL CB 組和30 μ g/mL CB 組相比差異顯著(P＜0.05);在囊胚率方面,20 μ g/mL CB組極顯著高于對照組(P＜0.01),同時它還顯著高于其它4個處理組(P＜0.05)。表明一定濃度的CB處理對冷凍后卵母細胞的后期發(fā)育能力有較大影響。

表2 不同濃度CB對牛成熟卵母細胞玻璃化冷凍發(fā)育能力的影響(n=3)Table 2 Effects on development capability of vitrified bovine matured oocytes treated with CB in different concentrations

3 討論

3.1 細胞松弛素B對卵母細胞玻璃化冷凍存活率的影響

本試驗中,以10倍遞增方式增設了3個處理組。其中SSV玻璃化凍融后存活率結(jié)果顯示,5個處理組的存活率與對照組差異均不顯著(P＞0.05)。這一結(jié)果與Legal F L[10]和Fujihira T等[11]在山羊和豬中的報道有所不同,Legal F L[10]認為,使用CB處理可提高山羊未成熟卵母細胞冷凍保存后的存活率。Fujihira T 等[11]報道,用7.5 μ g/mL CB 處理 30 min或5.0 μ g/mL CB處理10 min～30 min可以增加豬未成熟卵母細胞玻璃化冷凍后的存活率,并指出細胞松弛素作為細胞骨架松弛劑可以減弱細胞骨架基礎的堅固性。這可能與卵母細胞的發(fā)育階段和種間差異有關。

3.2 細胞松弛素B對卵母細胞玻璃化冷凍發(fā)育能力的影響

卵母細胞在冷凍保存中引起發(fā)育潛力降低是必然的,這主要是由于冷凍過程中滲透壓的變化會改變細胞骨架成分的理化特性和完整性,導致減數(shù)分裂進程異常和胚胎發(fā)育延遲[4-5,12],同時細胞內(nèi)外電解質(zhì)濃度的增加也會使細胞膜損傷,進而影響復蘇后卵母細胞的受精率[12,14-15]。CB是微絲抑制劑,在冷凍MⅡ期卵母細胞時能減弱對微管的損害并可能增加紡錘體微管的穩(wěn)定性[4,11]。當前,CB在不同種間卵母細胞玻璃化冷凍過程中的保護作用存在很大差異。在國外,Isachenko V等[6]報道,玻璃化冷凍豬GV期卵母細胞前用7.5 μ g/mL CB處理,解凍后卵母細胞成熟率為22.0%,而對照組僅為5.6%。Dobrinsky J R等[4]報道,超低溫冷凍保存擾亂了胚胎細胞膜和微絲的有序結(jié)構(gòu),而CB的加入可使這些微絲系統(tǒng)得到重構(gòu),形成新的骨架系統(tǒng)以支撐整個細胞,從而提高豬胚胎的冷凍效率。Vieira A D等[7]報道,OPS玻璃化冷凍牛未成熟(GV)卵母細胞用CB處理后,其卵裂率和囊胚率與對照冷凍組差異不顯著(49%和3.6%,46.4%和3.6%)。Fujihira T等[16]報道,玻璃化冷凍鯨未成熟卵母細胞,用CB處理組與未處理組的成熟率差異并不顯著(30.4%和27.3%)。Silvestre M A等[17]報道,在OPS玻璃化冷凍綿羊羔羊GV期卵母細胞時用CB預處理,其處理組(8.0%)與未處理組(12.7%)成熟率差異不顯著(P＞0.05)。Somfai T等[18]報道,CB可能會提高SSV玻璃化冷凍豬成熟卵母細胞后的存活率和發(fā)育率。張波等[19]報道,用5 μ g/mL CB預處理MⅡ期小鼠卵母細胞5 min,并沒有提高玻璃化凍融后存活率、受精率和卵裂率。周佰成等[20]用9 μ g/mL CB組處理綿羊GV期卵母細胞的成熟率顯著高于對照組(19.5%和16.7%)(P＜0.05)。張家新等[21]報道,用濃度7.5 μ g/mL或10.0 μ g/mL CB預處理綿羊成熟卵母細胞20 min～25 min可以提高玻璃化冷凍效果。卞桂華等[8]指出,7.5 μ g/mL CB處理MⅡ期水牛卵母細胞冷凍解凍后,激活后的分裂率差異顯著(55.56%和32.69%,P＜0.05),但存活率和囊胚率與未處理組相比差異均不顯著(88.89%、8.82%和94.20%、14.55%,P＞0.05)。

我們在牛卵母細胞玻璃化冷凍方面的試驗結(jié)果顯示,在卵裂率方面,20 μ g/mL CB組顯著高于對照組(P＜0.05),且它與 10 μ g/mL CB 組和 30 μ g/mL CB組相比差異顯著(P＜0.05);在囊胚率方面,20 μ g/mL CB組極顯著高于對照組(P≤0.01),同時它還顯著高于其他4個處理組(P＜0.05)。這表明CB在玻璃化冷凍過程中的保護作用存在一定濃度的依賴性,其中濃度20 μ g/mL CB對牛成熟卵母細胞玻璃化冷凍效果的改善作用最明顯。

從本試驗可以看出,即使 CB濃度提高到30 μ g/mL,對牛成熟卵母細胞冷凍后的存活率也沒有明顯的毒副作用。從數(shù)據(jù)分析來看,對冷凍的改善作用并沒有隨CB濃度遞增而一直遞增下去,而是到達一定濃度后就不再遞增,呈現(xiàn)出下降趨勢,其中的原因還有待進一步探索。

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Effects of Cytochalasin B on Vitrification of Bovine Mature Oocytes

GUO Juan1,2,W ANG Zhi-qin2,ZHAO Yun-cheng1,LIN Jia-peng1,HUANG Jun-cheng1

(1.The Key Labof Animal Biotechnology of Ministry of Agriculture,Xinjiang Academy of Animal Sciences,Urumqi,Xinjiang,830000,China;2.College of Veterinary Medicine,Xinjiang Agriculture University,Urumqi,Xinjiang,830052,China)

In the present study,effects of concentration of cytochalasin B(CB)on the development of bovine matured oocyte following solid surface vitrification(SSV)were examined.The results demonstrated that:no significant differences were observed in the survival rate among the control and treatment groups;However,after activation of oocytes,vitrified oocytes treated with 20 mg/mL CB resulted in a higher(47.67%and 30.25%,respectively,P＜0.05)cleavage development rate than that of the control,while the blastocyst development rates were significantly higher(9.00%and 1.75%,respectively,P≤0.01)than that of the control and other treatment groups(P＜0.05).In conclusion,the protective effects of CB have a certain concentration dependence in the vitrification process,especially pretreatment with 20 μ g/mL CB was beneficial for the vitrification of mature bovine oocytes.

oocyte;vitrification;bovine;cytochalasin B

S814.8

A

1007-5038(2010)03-0055-05

2009-09-21

新疆高技術(shù)研究與發(fā)展項目(200841122)和基金項目(200821182);國家863項目(2008AA101007)

郭 娟(1982-),女,河南人,碩士,主要從事動物生殖與發(fā)育研究。*通訊作者