目前在人體中已發(fā)現(xiàn)的乙醛脫氫酶(Acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)有19種，主要分布在肝、胃、心臟等器官中，最常見的有ALDH1～ALDH4四種。其中ALDH2處在線粒體內(nèi)，表現(xiàn)出基因多態(tài)性[1,2]，是人體酒精代謝的關鍵酶[3]，在肝臟和胃中有很高的表達量[4]。關于乙醛脫氫酶的研究很多，已報道了該酶的誘導劑、激活劑、抑制劑，并對該酶分離提純，還通過基因工程在大腸桿菌和植物體內(nèi)對該酶基因進行表達[5～8]，但目前采用基因工程的方法利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)ALDH2的報道仍較少。利用重組畢赤酵母分泌表達人乙醛脫氫酶2(ALDH2)時，由于在表達過程中失活嚴重，很難得到大量有活性的人ALDH2。

作者在此研究了人ALDH2在畢赤酵母中的高效表達[9]。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

含有密碼子優(yōu)化的人ALDH2的質(zhì)粒pPIC9K-07ALDH2，自行構建。畢赤酵母PichiapastorisSMD1168，武漢大學生命科學院。BamHI、EcoRI、SacI、 Taq酶，上海生工；DNA回收試劑盒，BBI。

1 mL Ni-NTA Agarose預裝柱，Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構建

(1)用BamHI、EcoRI雙酶切質(zhì)粒pPIC9K-07ALDH2去除信號肽(α-Factor)。將酶切的質(zhì)粒用DNA回收試劑盒回收，備用。

(2)將兩段合成的寡聚核苷酸鏈(5′-GATCCAAACGATGT-3′, 5′-AATTACATCGTTTG-3′)從90℃逐步降至4℃得到接頭。

(3)用T4 DNA Ligase連接回收的質(zhì)粒和接頭，并將連接的產(chǎn)物回收。

(4)為了避免殘留的pPIC9K-07ALDH2的干擾，用EcoRI酶切回收產(chǎn)物。

(5)將上一步的質(zhì)粒轉化至E.coliDH5α，并涂布在含氨芐青霉素的LB平板上。

(6)經(jīng)菌落PCR驗證得到E.coliDH5α(pPIC9K-ALDH2-delsign)。

1.2.2 基因工程菌株PichiapastorisSMD1168(pPIC9K-ALDH2-delsign)的構建

參照Invitrogen公司的畢赤酵母表達手冊，從E.coliDH5α(pPIC9K-ALDH2-delsign)中提取質(zhì)粒pPIC9K-07ALDH2，經(jīng)過SacI線性化，并用DNA回收試劑盒回收線性化質(zhì)粒，再將回收的線性化質(zhì)粒用Multiporator型電轉儀(Eppendorf公司)電轉化入感受態(tài)PichiapastorisSMD1168中，電轉化條件為：1200 V·mm-1，5 ms。用1 mol·L-1山梨醇懸浮后分別涂于MD平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～3 d，篩選具有遺傳霉素(G418)抗性的轉化子。

1.2.3 誘導表達

參照Invitrogen公司的畢赤酵母表達手冊，將PichiapastorisSMD1168 (pPIC9K-ALDH2-delsign)進行搖瓶發(fā)酵，用甲醇作誘導物誘導ALDH表達。將PCR驗證為陽性的菌株在YPD培養(yǎng)基中30℃、200 r·min-1培養(yǎng)24 h，按1%接種量接種至50 mL BMGY培養(yǎng)基中，在30℃、200 r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)18 h左右，離心收集菌體并將菌體接種于50 mL BMMY培養(yǎng)基中。誘導表達條件為：溫度28℃，pH值7.0，初始OD600=15，誘導72 h，每24 h補加1.2%甲醇。

1.2.4 分離純化

由于酵母自身ALDH酶活很高，為了盡量去除干擾，必須先分離純化后才可測定酶活。取發(fā)酵液離心收集菌體并用蒸餾水懸浮后用One shot型高壓破碎儀(Constant Systems)破碎，破碎液過Ni柱，經(jīng)過復合緩沖溶液(含0.5 mol·L-1NaCl、40 mmol·L-1咪唑的20 mmol·L-1磷酸鈉緩沖溶液，pH值7.1)和蒸餾水反復洗滌后，再用洗脫緩沖溶液(含0.5 mol·L-1NaCl、 500 mmol·L-1咪唑的20 mmol·L-1磷酸鈉緩沖溶液，pH值7.1)洗脫，收集目的蛋白，測定酶活。

1.2.5 酶活力測定

酶液在37℃條件下反應，用UV-2102型紫外可見分光光度計測定體系在340 nm下吸光度變化值，計算人ALDH2的酶活。酶活測定體系：1 mol·L-1Tris-HCl(pH值9.2) 300 μL， 100 mmol·L-1乙醛 200 μL， 3 mol·L-1KCl 100 μL， 1 mol·L-1巰基乙醇 30 μL，蒸餾水 1.07 mL，β-NAD 300 μL，酶液 1 mL。

2 結果與討論

2.1 表達載體的構建

將質(zhì)粒pPIC9K-07ALDH2用BamHI、EcoRI酶切，插入有同樣粘性末端的接頭，得到表達載體pPIC9K-ALDH2-delsign，如圖1所示。

圖1 pPIC9K-ALDH2-delsign的構建過程

以質(zhì)粒pPIC9K-07ALDH2為模版，5′AOX1(5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′)、3′AOX1(5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)為引物，進行PCR擴增，得到含α-Factor和人ALDH2基因的片段，理論長度為2053 bp；以α5′(5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′)、3′AOX1為引物，進行PCR擴增，得到含ALDH基因的片段，理論長度為1756 bp。

以質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2-delsign為模版，5′AOX1、 3′AOX1為引物，進行PCR擴增，得到含ALDH基因的片段，理論長度為1782 bp；以α5′、 3′AOX1為引物，因為去掉了信號肽(α-Factor)，理論上不會擴增。PCR鑒定結果如圖2所示。

圖2 表達載體PCR鑒定

圖2中，第1泳道是以5′AOX1、 3′AOX1為引物擴增pPIC9K-ALDH2-delsign，PCR擴增結果1.8 kb；第2泳道是以α5′、 3′AOX1為引物擴增pPIC9K-ALDH2-delsign;第3泳道是以5′AOX1、 3′AOX1為引物擴增pPIC9K-07ALDH2，PCR擴增結果2.0 kb；第4泳道是以α5′、 3′AOX1為引物擴增pPIC9K-07ALDH2，PCR擴增結果1.7 kb。由此可知，實際片斷大小與理論值相符。

2.2 分離純化與酶活測定

收集5 mLPichiapastorisSMD1168誘導表達48 h發(fā)酵液，離心得到的菌體經(jīng)5 mL蒸餾水懸浮后破碎，取3 mL破碎液經(jīng)Ni柱純化得到酶液。經(jīng)酶活測定，純化的酶液中酵母本身的ALDH殘留僅為(0.10±0.06)%，可忽略不計，說明分離純化能夠很好地避免酵母本身ALDH的干擾。

分別在PichiapastorisSMD1168 (pPIC9K-ALDH2-delsign)誘導表達24 h、48 h時取5 mL發(fā)酵液，離心得到的菌體經(jīng)5 mL蒸餾水懸浮后破碎，取3 mL破碎液經(jīng)Ni柱純化得到酶液。測定48 h純化的酶液的酶活力，為0.944 U·mL-1，即發(fā)酵液中人ALDH2的酶活為0.315 U·mL-1。

2.3 討論

(1)作者之前研究畢赤酵母分泌表達人ALDH2的過程中發(fā)現(xiàn)，只有在較低的溫度下誘導才能檢測到酶活(高于28℃完全沒有酶活)，并且誘導時間超過48 h后，蛋白表達量并沒有太大的變化，但是酶活明顯下降。因此推測在誘導過程中ALDH失活很嚴重，為了避免失活，嘗試采用胞內(nèi)表達，即將已構建的質(zhì)粒pPIC9K-07ALDH2去除信號肽(α-Factor)得到質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2-delsign，然后整合到PichiapastorisSMD1168中誘導表達。去掉信號肽使ALDH在胞質(zhì)中表達。

(2)利用胞內(nèi)表達的重組畢赤酵母誘導表達后得到發(fā)酵液的人ALDH2酶活為0.315 U·mL-1，而作者以前構建的兩株胞外表達的重組PichiapastorisGS115(pPIC9K-07ALDH2)和PichiapastorisSMD1168(pPIC9K-07ALDH2) 誘導表達后得到發(fā)酵液的人ALDH2酶活分別是0.110 U·mL-1、0.115 U·mL-1。胞內(nèi)表達人ALDH2的酶活是胞外的2.7～2.8倍，這說明胞內(nèi)表達能夠明顯降低人ALDH2的失活。

(3)本實驗表達的人ALDH2含有6×His標簽，便于利用親和色譜分離純化酶活較高的ALDH。若進一步進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，應可以大量制備人ALDH2，為人ALDH2的相關研究和應用打下良好的基礎。

3 結論

去除自行構建的質(zhì)粒pPIC9K-07ALDH2的信號肽(α-Factor)得到質(zhì)粒pPIC9K-ALDH2-delsign，采用電轉化方法將該質(zhì)粒轉化到PichiapastorisSMD1168中構建得到能在胞內(nèi)高效表達人ALDH2的基因工程菌株PichiapastorisSMD1168 (pPIC9K-ALDH2-delsign)。利用該重組畢赤酵母搖瓶發(fā)酵得到的發(fā)酵液的人ALDH2酶活為0.315 U·mL-1，明顯高于胞外表達時人ALDH2的酶活。經(jīng)過親和色譜分離純化后的人ALDH2酶液的酶活為0.944 U·mL-1。

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