劉蘭亞,陳春花,許玉靜,宋勤葉,李潭清

腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)屬于微 RNA病毒科、心病毒屬成員,其易感宿主廣泛,是多種脊椎動物和人類腦心肌炎的病原,可導(dǎo)致動物和人類發(fā)生腦炎、心肌炎或心肌周圍炎〔1-3〕。大鼠和小鼠是EMCV的自然宿主,家畜中以豬對EMCV的易感性最高,哺乳仔豬感染后出現(xiàn)急性致死性心肌炎,死亡率可達(dá)100%,妊娠母豬則以流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙為主要特征,其他豬多呈隱性感染狀態(tài)〔4-6〕。據(jù)報道豬腦心肌炎高發(fā)地區(qū),人 EMCV感染的病例也較高〔7〕。人類感染EMCV后出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、頸部僵硬、昏睡、譫語、嘔吐等癥狀,有學(xué)者從患腦膜炎和腦炎的兒童體內(nèi)分離到EMCV,并從患者和其他正常人群血清中檢測到EMCV 抗體〔2-3,8〕。

豬腦心肌炎自1958年首次在巴拿馬報道并證明EMCV為其病原后,目前全球多個國家和地區(qū)有該病發(fā)生和流行的報道,但不同地區(qū)EMCV的抗體陽性率不同〔6,9,10-11〕。國內(nèi)于2007年首次從病死仔豬或流產(chǎn)胎兒分離到EMCV,隨后證明了多個省區(qū)的豬場有EMCV感染存在,不同地區(qū)的抗體陽性率在39.64%～90%之間〔12-14〕。鑒于 EMCV 是一個重要的人獸共患病致病因子,因此,明確當(dāng)?shù)刎i場EMCV感染的流行狀況,對減少豬場經(jīng)濟損失和保證人類健康均具有重要意義。本文旨在對河北省不同豬場EMCV的感染情況進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查,以便為EMCV的有效防控提供流行病學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 血清樣本 2006-2008年,從河北保定、滄州、承德、邯鄲、廊坊、衡水、唐山、秦皇島、石家莊、邢臺等10個地區(qū)的31個規(guī)?；i場采集的不同生長階段豬的血清樣本,共計1 306份。

1.2 試劑 EMCV重組非結(jié)構(gòu)蛋白2C與豬EMCV抗體陽性、陰性血清:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室制備并保存;小牛血清:購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司;HRP-羊抗豬 IgG:購自Solarbio公司。

1.3 EMCV抗體檢測 應(yīng)用間接ELISA方法檢測血清抗體,包被抗原(EMCV重組蛋白2C)的制備與ELISA操作程序參見文獻(xiàn)〔15〕。ELISA的基本操作步驟如下:以1 μ g/mL的重組蛋白2C包被酶標(biāo)板,于37℃孵育1 h后4℃作用過夜;PBST(含0.05%Tween-20的 0.01 mol/L pH7.4 PBS)洗板3次,3 min/次;每孔加入100μL封閉液(含5%犢牛血清的PBST)于37 ℃封閉1 h;棄去封閉液,每孔加入1︰20倍稀釋的待檢血清100μL于37℃下反應(yīng) 1 h;洗板,方法同上;每孔加入 100μL 1 ︰400稀釋的酶標(biāo)二抗,于37℃反應(yīng)45 min;洗板,方法同上;每孔加入100μL底物(TMB),于室溫避光顯色 15 min,加入 50μL 2 mol/L H2SO4終止液 ,終止反應(yīng);用酶聯(lián)檢測儀測定OD450nm光吸收值。當(dāng)被檢樣本的 OD450 nm值＞0.27時,判定為陽性;當(dāng)OD450 nm值＜0.27時,判定為陰性。

2 結(jié) 果

2.1 河北省豬群腦心肌炎抗體的ELISA監(jiān)測結(jié)果被檢測的1 306份血清樣本中,腦心肌炎抗體的總陽性率為13.48%(176/1 306),調(diào)查的10個地區(qū)中6個為抗體陽性。抗體陽性地區(qū)的感染率不同(5%～26%)(表1)。上述結(jié)果表明,河北省60%(6/10)的地區(qū)已經(jīng)存在豬EMCV感染現(xiàn)象,但不同地區(qū)的感染情況存在差異。

2.2 不同生長階段豬群EMCV抗體陽性率的比較依據(jù)EMCV抗體檢測結(jié)果,對569份EMCV抗體陽性血清與豬日齡的關(guān)系進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)不同生長階段豬的EMCV抗體陽性率不同,其中經(jīng)產(chǎn)母豬與后備母豬的抗體陽性率較高,分別為27.68%(31/112)和16.67%(5/30),仔豬與育成豬的抗體陽性率較低,分別為2.86%(5/175)和1.98%(5/252)(圖1)。該結(jié)果表明,帶毒母豬是豬群EMCV感染發(fā)生的主要原因之一。

表1 血清來源及EMCV抗體陽性率Table 1 Source of swine serum samples and positive rates of antibody to EMCV

圖1 不同生長階段豬群EMCV抗體陽性率Fig.1 Positive rates of antibodies to EMCV in pigs at different ages

3 討 論

EMCV廣泛流行于歐洲、美洲、亞洲等世界多個國家和地區(qū)〔6,9-11,14〕,不僅可以直接導(dǎo)致哺乳仔豬急性死亡和妊娠母豬繁殖障礙,而且能夠在成活豬群中呈隱性感染形式長期存在,給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。同時,由于其易感宿主廣泛,可以跨種間傳播,尤其是能夠引起人類感染與發(fā)病〔2-3,7〕,已有實驗證明EMCV可以在人心肌細(xì)胞內(nèi)增殖〔16〕,并且豬與人類關(guān)系密切,豬的組織器官是動物—人類間器官移植的首選對象。因此,開展豬EMCV感染的流行病學(xué)調(diào)查對豬腦心肌炎的有效防治與保證人類健康具有重要實踐意義。豬腦心肌炎流行病學(xué)調(diào)查常用的血清學(xué)方法為血清中和試驗(SNT),但SNT操作繁瑣、費用較高,不適合進(jìn)行大規(guī)模樣本檢測,在一定程度上影響和限制了豬腦心肌炎流行病學(xué)調(diào)查資料的廣泛獲取和臨床診斷。先前研究〔15〕已證實基于EMCV重組非結(jié)構(gòu)蛋白2C的間接ELISA與SNT的符合率為96%,特異性高,不與感染豬的常見病原如豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病毒等的抗體發(fā)生交叉反應(yīng),可以取代SNT用于EMCV感染的早期診斷與血清流行病學(xué)調(diào)查。所以本研究中采用了基于EMCV重組非結(jié)構(gòu)蛋白2C作為包被抗原的間接ELISA方法檢測EMCV抗體。

對2006-2008年間河北省10個地區(qū)31個豬場的1 306份血清樣本的檢測結(jié)果顯示,EMCV抗體總陽性率為13.48%,高于法國(2006)和韓國(2009)豬群EMCV抗體的監(jiān)測結(jié)果(2.48%和9.1%)〔11,17〕,但低于張家龍等(2007)〔14〕報道 的2005-2006年間河北部分豬場的EMCV抗體陽性率85.04%,這可能與血清來源和采集時間不同有關(guān),因為一種疫病在不同地區(qū)或豬場、同一地區(qū)不同時期的感染與流行情況常存在明顯差異。在被調(diào)查的10個地區(qū)中6個檢測到了相應(yīng)的抗體,4個為抗體陰性,表明河北省大多數(shù)地區(qū)已經(jīng)存在EMCV感染現(xiàn)象,但不同地區(qū)豬場EMCV的感染率不同(5%～26%)。此結(jié)果提示,有關(guān)部門應(yīng)重視豬腦心肌炎的防控,以免其進(jìn)一步擴散與流行,甚至引發(fā)公共衛(wèi)生事件。

進(jìn)一步對不同飼養(yǎng)階段豬的EMCV抗體陽性率的分析結(jié)果表明,經(jīng)產(chǎn)母豬和后備母豬的抗體陽性率(27.68%和16.67%)明顯高于仔豬和育成豬(2.86%和1.98%),該結(jié)果與文獻(xiàn)〔9〕報道的美國依俄華州成年母豬和后備母豬的抗體陽性率(17.2%)高于育成豬(12.2%)的分布趨勢類似。同樣,國內(nèi)2005-2006年間豬群EMCV感染的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果也表明母豬的抗體陽性率(96.39%)高于其他生長階段豬的抗體陽性率〔14〕。綜合上述不同國家(地區(qū))或時期豬EMCV感染的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果,充分說明種母豬在EMCV的傳播與流行中占有重要地位,并提示在豬繁殖障礙疫病中EMCV的作用不容忽視,因此需要進(jìn)一步加強豬群繁殖障礙類疫病的病原學(xué)研究,明確EMCV的危害,為制定有效防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

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