潘方平,吳璐怡,葉云飛,孫愛華

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是人類細菌性肺炎的主要病原體,也可引起腦膜炎、敗血癥的中耳炎等疾病〔1〕。近年來,許多國家和地區(qū)對β-內(nèi)酰胺類及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的肺炎鏈球菌菌株流行日益廣泛,導致相關疾病發(fā)病率逐年升高〔2-4〕,我國也不例外〔5-6〕。與 β-內(nèi)酰胺類抗生素不同,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不易引起過敏反應,因而在臨床上使用日趨增加,導致大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性肺炎鏈球菌株普遍流行且具有明顯的地區(qū)差異〔2,5〕。有文獻報道,肺炎鏈球對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機制主要涉及ermB和mef E基因〔7-8〕。因此,調(diào)查我國不同地區(qū)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性肺炎鏈球菌流行狀況及其ermB和mefE基因相關耐藥機制具有重要意義。

本研究中,我們收集了浙江省各個地區(qū)臨床分離的138株肺炎鏈球菌,采用藥物敏感試驗檢測了上述菌株對9種臨床常用抗生素的耐藥性,采用PCR檢測了上述菌株中ermB和mef A基因分布,以初步了解本地區(qū)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性肺炎鏈球菌的流行情況及其主要耐藥模式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 138株肺炎鏈球菌臨床菌株分離自2006年至2009年浙江省不同地區(qū)病人臨床標本并經(jīng)系統(tǒng)的細菌學鑒定。藥敏試驗質(zhì)控菌株肺炎鏈球菌ATCC49619購自衛(wèi)生部臨檢中心,金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922和大腸埃希菌DH5α株由浙江大學醫(yī)學院病原生物學系提供。肺炎鏈球菌接種于含5%脫纖維羊血的MH瓊脂平板上,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng);金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌接種于MH瓊脂平板上37℃培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 各抗生素E-test條或紙片分別購自瑞典AB-BioDisk公司及杭州天和微生物制劑有限公司。MH瓊脂購自英國Oxoid公司。細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海博彩生物科技有限公司(BioColor)。PCR試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和T-A克隆試劑盒購自大連寶生物有限公司(TaKaRa)。

1.2 方法

1.2.1 細菌基因組DNA模板制備 將新鮮細菌培養(yǎng)物3 000 r/min離心,取沉淀的菌體用0.01mol/L、pH7.4的磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌、離心3次后取沉淀。參照細菌基因組DNA提取試劑盒(BioColor)說明書,提取各菌株基因組DNA。提取的DNA溶于T ris-HCl-EDTA(TE)緩沖液中,采用紫外分光光度法測定DNA濃度和純度〔9〕。

1.2.2 PCR 參考GenBank中登錄的ermB基因(accession No.:AJ243540)和 mefE基因(accession No.:AF274302)序列及相關文獻設計引物〔10-11〕。擴增ermB 基因片段(1114～ 1851 bp)引物序列:上游5'-GAA AAA GTA CTC AAC CAA ATA-3',下游 5'-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GT T-3'。擴增mefE基因片段(1741～2006 bp)引物序列:上游5'-agg gag atg aaa gaa gga-3',下游5'-ATA AAA TGG CAC CGA AAG CCC-3'。引物由上海英駿生物技術有限公司(Invitrogen)合成。PCR總體積為100μL,內(nèi)含2.5 mol/L各 dNTP、250 nmol/L各引物、2.5 U Taq-Pfu酶(TaKaRa)、100 ng DNA模板和 1×PCR緩沖液(pH8.3)。PCR參數(shù):94℃5 min;94℃30s、54℃30s、72℃45s(mefE基因片段)或60s(ermB基因片段),35個循環(huán);72℃7 min。采用溴乙錠預染的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,ermB和mef E基因片段目的擴增片段預期大小分別為639 bp和366 bp。

1.2.3 目的擴增產(chǎn)物克隆和測序 為了核實PCR擴增產(chǎn)物的特異性,采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TaKaRa)提取部分陽性目的擴增片段。按T-A克隆試劑盒(TaKaRa)說明書,將提取ermB和mef E基因片段擴增產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體中,形成重組質(zhì)粒 pMD18-TermB和 pMD18-TmefE,轉化入 E.coli DH5α中擴增后,采用小量堿變性法提取重組質(zhì)粒〔9〕,委托上海Invitrogen公司測序。

1.2.4 藥敏試驗 采用K-B紙片法和E-test檢測138肺炎鏈球菌臨床菌株對9種抗生素的敏感性。E-test法嚴格按照產(chǎn)品說明書進行操作和判讀結果,K-B紙片法參照NCCLS標準判讀結果〔12〕。實驗中分別采用肺炎鏈球菌ATCC49619、金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC25922株進行質(zhì)量控制。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SSPS 11.0統(tǒng)計軟件,對ermB和mef E基因檢測陽性率及耐藥率進行χ2檢驗,P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 ermB和mef E基因PCR檢測結果 肺炎鏈球菌臨床菌株的ermB和mef E基因PCR檢測效果見圖1和圖2。138株肺炎鏈球菌菌株中,91.3%(126/138)檢出ermB基因,33.3%(46/138)檢出mef E基因,其中38株ermB和mef E基因檢測結果均陽性,ermB基因攜帶率(91.3%)明顯高于mef E基因(33.3%)(P＜0.05)。

2.2 ermB和mef E基因PCR產(chǎn)物測序結果 9株肺炎鏈球菌臨床菌株ermB和mefE基因片段PCR產(chǎn)物測序結果見圖3和圖4。與GenBank中ermB基因(accession No.:AJ243540)和mef E基因(accession No.:AF274302)序列比較,除引物序列外上述肺炎鏈球菌臨床菌株ermB和mef E基因片段核苷酸序列相似性分別為99.16%～100%和99.08%～100%。

2.3 藥敏試驗結果 138株肺炎鏈球菌臨床菌株中,對紅霉素耐藥率高達93.5%(129/138),對青霉素、喹奴普達/達福普汀的氯霉素和耐藥率為18.8%～42.0%,但對頭孢噻肟、頭孢呋辛、阿莫西林和左氧氟沙星的耐藥率較低(2.9%～4.3%),未發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素菌株(表1)。

2.4 ermB和mef E基因與紅霉素耐藥性關系138株肺炎鏈球菌臨床菌株中,無ermB及mef E基因的所有4株菌株、2株僅含ermB基因和2株僅含mef E基因菌株對紅霉素敏感,其余菌株均對紅霉素耐藥(表2)。

3 討 論

青霉素是治療革蘭陽性肺炎鏈球菌感染性疾病的首選藥物。由于青霉素可導致嚴重的藥物過敏反應,作為大環(huán)內(nèi)酯類代表性抗生素的紅霉素,被廣泛用于肺炎鏈球菌感染相關疾病。隨著青霉素和紅霉素的廣泛應用,臨床上相關耐藥肺炎鏈球菌菌株的分離率逐年升高〔2-6〕。在亞洲地區(qū),肺炎鏈球菌臨床菌株對紅霉素耐藥現(xiàn)象尤其嚴重〔4〕,我國重慶、上海和青島等地近年報道的肺炎鏈球菌對紅霉素耐藥率高達96.0%～100%〔5-6〕。本研究中,浙江地區(qū)分離的138株肺炎鏈球菌臨床菌株對紅霉素耐藥率也高達93.5%(129/138),但對青霉素耐藥率也為18.8%,對阿莫西林、頭孢噻肟和頭孢呋辛耐藥率分別僅為2.9%、2.9%和4.3%,提示紅霉素已不適合作為肺炎鏈球菌感染性疾病的臨床藥物,β-內(nèi)酰胺類及頭孢菌素類可作為臨床上治療肺炎鏈球菌感染性疾病的一線藥物。

表1 138株肺炎鏈球菌臨床菌株對10種抗菌藥物的耐藥率Table 1 Drug resistant ratios against 10 antibacterial drugs of 138 S.pneumoniae isolates

表2 ermB和mefE基因與紅霉素耐藥相關性Table 2 Correlation among ermB/mef E genes and erythromycin/clindamycin

肺炎鏈球菌ermB基因編碼紅霉素耐藥相關核糖體甲基化酶,該基因通常定位在細菌染色體上,其轉座也通常發(fā)生在染色體與染色體之間,在核糖體甲基化酶作用下,細菌23 SrRNA第25位腺嘌呤殘基N-6位甲基化,降低了細菌核糖體與紅霉素的結合力,可介導細菌對所有大環(huán)內(nèi)酯類的高水平耐藥〔10〕。肺炎鏈球菌mef E基因是細菌主動外排基因操縱子元件,編碼一種能量依賴的膜藥物外排泵蛋白,可將14、15元環(huán)紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素泵出細菌細胞外,使細菌產(chǎn)生低水平耐藥性〔10-11〕。為了解本地區(qū)肺炎鏈球菌臨床菌株ermB和mef E基因攜帶率,我們采用PCR對上述菌株兩種目的基因進行了檢測,測序結果表明,擴增產(chǎn)物確為ermB或mef E基因,99.08%～100%序列相似性提示該兩個基因序列極為保守。PCR結果顯示,138株肺炎鏈球菌臨床菌株中,ermB基因攜帶率很高(91.3%),mef E基因攜帶率較低(33.3%),27.5%菌株(38/138)同時攜帶上述兩種基因,表明ermB基因是本地區(qū)肺炎鏈球菌臨床菌株紅霉素耐藥相關優(yōu)勢基因(P＜0.05)。

肺炎鏈球菌對紅霉素耐藥機制在不同國家和地區(qū)頗有差異。在歐洲和亞洲,肺炎鏈球菌對紅霉素耐藥性主要由ermB基因表達產(chǎn)物介導〔5-6,13-15〕;在美國和加拿大,攜帶mef E基因的肺炎鏈球菌菌株對紅霉素耐藥更為常見〔7-8〕。本研究中138株肺炎鏈球菌臨床菌株ermB和mef E基因攜帶狀態(tài)與紅霉素耐藥相關性分析結果顯示,不攜帶上述兩種基因菌株均對紅霉素敏感,僅攜帶mef E基因菌株對紅霉素耐藥率(62.5%)明顯低于同時攜帶兩種基因菌株耐藥率(100%)及僅攜帶ermB基因菌株耐藥率(97.7%)(P＜0.05),提示ermB和mef E基因不僅確與肺炎鏈球菌紅霉素耐藥密切相關,且ermB基因可使細菌產(chǎn)生較mef E基因更強的紅霉素耐藥性。

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