盧月梅,張阮章,胡玉華,鐘運(yùn)華,武學(xué)成,陳升汶,王沙燕

隨著抗生素的大量使用,病原菌產(chǎn)生多種耐藥機(jī)制以逃避抗生素的攻擊。β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床上用得最多的抗生素,產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對(duì)該類抗生素耐藥的最重要和最常見的機(jī)制。由于β-內(nèi)酰胺酶編碼基因的突變,導(dǎo)致新型β-內(nèi)酰胺酶的不斷出現(xiàn)。LEN-5為本研究組首次發(fā)現(xiàn)于深圳市人民醫(yī)院臨床分離株的β-內(nèi)酰胺酶(GenBank登錄號(hào)為AY790341)〔1〕。為了進(jìn)一步研究酶的特性,本研究對(duì)LEN-5基因進(jìn)行原核表達(dá)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 含LEN-5質(zhì)粒由深圳市人民醫(yī)院臨床分離株中獲得;pET26b(+)表達(dá)載體購于默克公司、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌 BL21(DE3)購自上海生工,SHV-1型標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)酶菌由陳民均教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 PCR引物由Invitrogen公司合成,限制性內(nèi)切酶 Nde I、Xho I、T4連接酶、高保真Pfu DNA聚合酶為Fermentas公司產(chǎn)品、膠回收試劑盒為QIAgen公司產(chǎn)品、異丙基硫代-β-D半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、質(zhì)粒提取試劑盒為BBI公司產(chǎn)品;Nitrocefin購自基因公司,兩性電解質(zhì)載體凝膠(pH3～10)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)(pH 3～10)為Amersham公司產(chǎn)品。凝膠純化試劑盒(QIAquick Gel Extraction kit)為 QIAgen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增LEN-5基因 根據(jù)LEN-5編碼基因序列(gb|AY790341)設(shè)計(jì)PCR引物并分別引入Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)。正向引物:5 -ATTGTGCATATGCGT TATATTCGCCTGTGTATTAT(劃線為 Nde I酶切位點(diǎn)),反向引物:5 -ATACTGCTCGAGGCGTTGCCAGTGCTCGATC(劃線為 Xho I酶切位點(diǎn))。以含LEN-5基因的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行 PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為:95℃5min,接著 94℃45s、58℃45s、72℃60s,共 30個(gè)循環(huán),72℃延伸 10min。目的PCR產(chǎn)物為879bp。設(shè)大腸埃希菌ATCC25922為陰性對(duì)照,SHV-1型標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)酶菌為陽性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。

1.2.2 pET-26b(+)/LEN-5重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 LEN-5擴(kuò)增產(chǎn)物和pET-26b(+)質(zhì)粒分別用Nde I、Xho I雙酶切,經(jīng)瓊脂糖凝膠切膠純化,用T4連接酶于16℃連接過夜后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,再將轉(zhuǎn)化菌涂布于含卡那霉素(濃度30μ g/mL)的 LB平板上,于 37℃培養(yǎng)過夜,挑取單菌落擴(kuò)增培養(yǎng),提取質(zhì)粒,予酶切電泳鑒定,并對(duì)插入質(zhì)粒載體中的目的片斷進(jìn)行DNA測(cè)序。待確證插入片斷為目的基因后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3),用含卡那霉素的LB平板上進(jìn)行篩選。該方案使重組的LEN-5基因在pET-26b(+)質(zhì)粒T7啟動(dòng)子的控制下,形成6×His的融合蛋白。

1.2.3 重組大腸桿菌BL21(DE3)的誘導(dǎo) 挑取確證的重組菌單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基中,37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,吸取1mL加至30mL LB培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng),當(dāng)菌體密度生長(zhǎng)至OD600為0.6時(shí),加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0 mmol/L,37℃振蕩4 h后,離心收集細(xì)胞并懸浮于0.01 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)1.5mL中,冰浴中超聲破碎,參數(shù)為:750W,振幅 35%,處理2,間隔5s,共 8min。裂解液 13 000 r/min,4℃離心 30 min,上清液為β-內(nèi)酰胺酶粗提液。上清液用頭孢硝噻吩(Nitrocefin)檢測(cè)活性,如果細(xì)菌裂解液能使黃色頭孢硝噻吩(Nitrocefin)變?yōu)榧t色,表明細(xì)菌表達(dá)有活力的酶。

1.2.4 等電點(diǎn)的測(cè)定 為了避免6×his標(biāo)簽對(duì)β-內(nèi)酰胺酶等電點(diǎn)的影響,針對(duì)基因序列重新設(shè)計(jì)反向引物,使反向引物位于終止密碼子之外,引物為5-ATACTGCTCGAGCCAGTCATATCGCCCGGCAC(劃線為Xho I酶切位點(diǎn)),與上述正向引物配對(duì)重新對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和表達(dá)(方法同上),表達(dá)產(chǎn)物用于等電點(diǎn)的測(cè)定,取β-內(nèi)酰胺酶粗提液2μL,與等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行電泳,用Model III Mini IEF Cell電泳儀(BIO-RAD公司)進(jìn)行等電聚焦電泳,電泳條件如下:先100V電泳15min。之后增加電壓到200V電泳 15min。最后450V電泳60min。電泳結(jié)束后先用頭孢硝噻吩(nitrocefin)染色,測(cè)量條帶至陽極的距離,再用考馬斯亮藍(lán)染色,測(cè)各PI標(biāo)準(zhǔn)條帶至陽極的距離并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算β-內(nèi)酰胺酶LEN-5的等電點(diǎn)(PI)。

2 結(jié) 果

2.1 LEN-5基因PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示在約 800～900bp位置出現(xiàn)一條帶(圖1),與引物設(shè)計(jì)的擴(kuò)增片段基本吻合(圖1)。

圖1 LEN-5基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 electropherogram of LEN-5 gene PCR amplification

2.2 pET26b(+)/LEN-5重組質(zhì)粒的鑒定和表達(dá)由重組DH5α大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒pET26b(+)/LEN-5,經(jīng) Nde I和Xho I雙酶切后得到861 bp和5230 bp兩條片段(圖2),對(duì)插入的目的基因的測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致,表明LEN-5基因已成功克隆。BL21(DE3)重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后,取 2μL重組菌裂解液加入1μL頭孢硝噻吩(1 mmol/L)中,幾秒鐘后頭孢硝噻吩由黃變紅,而轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的陰性菌裂解液不能使之變色,確證重組質(zhì)菌構(gòu)建成功,且其表達(dá)產(chǎn)物具有酶活力。

2.3 LEN-5等電點(diǎn)的檢測(cè) 根據(jù)等電點(diǎn)(pI)標(biāo)準(zhǔn)蛋白各條帶與陽極的距離,應(yīng)用SPSS軟件13.0進(jìn)行線性回歸,以條帶與陽極的距離為自變量(X),pI為因變量(Y),獲得回歸方程Y=0.024X+4.86,根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物與陽極的距離算出PI為7.6(圖3)。

3 討 論

LEN 型 β-內(nèi)酰胺酶由 Yoshichika等〔2〕在 1986年首次報(bào)道,他們從一株肺炎克雷伯菌株(LEN-1)染色體DNA中克隆出一種β-內(nèi)酰胺酶基因,發(fā)現(xiàn)它可導(dǎo)致菌株對(duì)氨芐青霉素耐藥,因此將該β-內(nèi)酰胺酶稱為L(zhǎng)EN-1。研究顯示LEN-1屬于A類,2 a組β-內(nèi)酶胺酶,主要由肺炎克雷伯菌染色體基因編碼產(chǎn)生,其編碼基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含279個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為7.1。與質(zhì)粒介導(dǎo)的 TEM-1 β-內(nèi)酰胺酶的氨基酸序列同源性為 67%〔2〕。

本次研究的LEN-5型酶與LEN-1差異較大,如LEN-5含286個(gè)氨基酸,其等電點(diǎn)為7.6,兩者氨基酸序列同源性為96.2%〔1〕。氨基酸序列的差異可導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶特性的變化,為了獲得高產(chǎn)量、高純度的β-內(nèi)酰胺酶以便進(jìn)一步分析酶的特性,本實(shí)驗(yàn)選用PET-26b(+)質(zhì)粒對(duì)LEN-5基因進(jìn)行了克隆及原核表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物為帶6×His標(biāo)簽的融合蛋白,帶這種His標(biāo)簽的融合蛋白方便了下游的純化,通過親和層析法可獲得高純度LEN-5酶。由于一株細(xì)菌可同時(shí)產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶〔3-4〕,與天然產(chǎn)酶菌相比,應(yīng)用基因工程技術(shù)表達(dá)該酶可以避免多種β-內(nèi)酰胺酶的相互干擾 ,更確切地研究該β-內(nèi)酰胺酶的性質(zhì)。PET-26b(+)/LEN-5表達(dá)載體的成功構(gòu)建和表達(dá),為進(jìn)一步研究酶動(dòng)力學(xué)以及其它特性奠定了基礎(chǔ)。

〔1〕Chen SW,Zhang RZ,Lu YM,et al.A novel LEN-derived β-lactamase from K lebsiela pneumoniae〔J〕.Chin Med J,2005,118(16):1380-1383.

〔2〕Arakawa Y,Ohta M,Kido N,et al.Close evolutionary relationship between the chromosomally encoded β-lactamase gene of K lebsiella pneumoniae and the TEM-1β-lactamase gene mediated by R-plasmids〔J〕.FEBS Lett,1986,207(1):69-74.

〔3〕盧月梅,陳升汶,何林,等.呼吸道產(chǎn)ESBLs分離株耐藥基因的研究〔J〕.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2004,16(6):340-341.

〔4〕Tofteland S,Haldorsen B,Dahl K,et al.Effects of phenotype and genotype on methods for detection of extended-spectrum-βlactamase-producing clinical osolates of Escherichia coliand K lebsiella pneumoniae in Norway〔J〕.J Clin Microbiol,2007,45(1):199-205.