劉婷婷,馬麗娜,李鳳云,劉 勇,樊 蓉

傷寒沙門菌(Salmonella typhi,S.typhi)是重要的腸道致病菌,屬胞內(nèi)寄生菌,它可引起傷寒等嚴重疾病。巨噬細胞是人體主要的吞噬細胞,它在許多病原體的清除和破壞中起重要作用。傷寒沙門菌在巨噬細胞內(nèi)生存、增殖的能力與其致病密切相關(guān)。越來越多的研究報道傷寒沙門菌可以引起吞噬細胞的凋亡〔1〕,但傷寒沙門菌誘導巨噬細胞凋亡機制還有待進一步研究,本實驗擬采用人白血病細胞系

THP-1細胞經(jīng)PMA(佛波醇酯)分化的巨噬細胞為模型,探討傷寒沙門菌對巨噬細胞凋亡的機制,以深入了解傷寒沙門菌的致病機制。

1 材料與方法

1.1 菌種 傷寒沙門菌標準菌株,購自生物制品鑒定所。

1.2 主要試劑與儀器 Annexin FITC凋亡檢測試劑盒(深圳晶美生物工程公司)caspase3/8/9比色法檢測試劑盒(Biovision公司),caspase3/8/9抑制劑(Biovision公司),抗人 TNF-α抗體(Peprotechinc公司)及人TNF-α定量酶聯(lián)檢測試劑盒(上海森雄生物技術(shù)有限公司),NO檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所),流式細胞儀FACSCalibur(美國BD公司)。

1.3 細胞培養(yǎng) 用含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)THP1細胞,加入20 ng/mL PMA使其分化,37。C ,5%CO2條件下培養(yǎng)48h,鏡下觀察90%以上細胞出現(xiàn)棘狀突起,認為細胞已分化成巨噬細胞,收獲指數(shù)生長期巨噬細胞,以5×105接種于無菌六孔板中,常規(guī)培養(yǎng)5h后更換成不含小牛血清的營養(yǎng)液進行試驗。

1.4 細菌培養(yǎng) 細菌在LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng),16h后使用酶標儀OD 600檢測菌液濃度,用不含小牛血清1640調(diào)整菌液濃度。

1.5 實驗方法

1.5.1 細胞感染 棄去細胞培養(yǎng)孔中陳舊培養(yǎng)液,加入1.0 mL不含小牛血清營養(yǎng)液,按細菌與細胞數(shù)之比為20∶1加入細菌,實驗分組如下:A組:傷寒沙門菌誘導組;B組:空白對照組。

1.5.2 細胞凋亡檢測 2組于誘導因素加入后8h分別收集細胞,Annexin V-FITC染色,1h內(nèi)流式細胞儀檢測,Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù),WinMDI2.9軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5.3 凋亡抑制效應檢測 在培養(yǎng)的細胞中加入終濃度分別為 20μg/mL TNF-α抗體、2μmol/mL caspase3/8/9抑制劑,各組誘導因素作用8h后收集細胞,Annexin V-FITC染色、流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5.4 caspase3/8/9、TNF-α、NO 的檢測:各組于誘導因素加入 8h后,獲得上清后采用定量酶聯(lián)法檢測 TNF-α,按照說明書進行操作,酶標儀測量492nm處光密度OD值,根據(jù)標準曲線得到TNF-α含量。Caspase3/8/9檢測采用比色法,收集作用8h后的細胞,按照說明書操作,酶標儀檢測405 nm時的OD值。NO的檢測采用硝酸還原酶法,檢測步驟按說明書進行。測定550 nm吸光度值,根據(jù)公式計算NO濃度值。

1.6 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0進行計算和分析。采用one-way ANOVA后t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 分別加入caspase3,caspase8,caspase9抑制劑及TNF-α抗體后傷寒沙門菌誘導巨噬細胞凋亡的流式分析圖。

圖1 加入caspase3/8/9抑制劑及抗TNF-α后傷寒沙門菌誘導巨噬細胞8h凋亡的AnnexinV-FITC流式分析圖Fig.1 Analysis of Annexin V-FITC in macrophage apoptosis induced by S.typh i after theinhibitor of caspase3/8/9 and theanti-TNF-αThe marker M1 shows the percentage of Annexin positivecells.The black of the figure is the control.

2.2 比色法檢測細胞中caspase3,caspase8,caspase9含量,傷寒沙門菌誘導巨噬細胞8 h收集細胞,使用細胞裂解液裂解,釋放細胞內(nèi)caspase3,caspase8,caspase9,分別加入相應熒光底物,酶標儀讀取OD值,結(jié)果caspase3,caspase8均較對照升高(圖 2)。

圖2 傷寒沙門菌原菌誘導巨噬細胞8 h caspase3,caspase8,caspase9產(chǎn)生量(ni=6,±s)與對照組組比較:*P＜0.01;Fig.2 Caspase3,caspase8,caspase9 activity of macrophages infected with Salmonella typhi after 8h incubation compared to control:*P＜0.01

2.3 檢測細胞培養(yǎng)液中TNF-α,NO含量,傷寒沙門菌誘導巨噬細胞8 h收集細胞培養(yǎng)液,采用硝酸還原酶法檢測NO含量,ELISA檢測TNF-α含量,結(jié)果均較對照組顯著增高。(見圖3,4)

圖3 傷寒沙門菌誘導巨噬細胞8h NO產(chǎn)生量(ni=6, ±s)與對照組比較:*P＜0.01;Fig.3 NO(μmol/l)in the culture supernatants of macrophages infected with Salmonella typhi after 8 hours compared to control:*P＜0.01

3 討 論

傷寒沙門菌感染致病的重要機制之一是在細胞內(nèi)寄生,甚至繁殖。單核吞噬細胞是引發(fā)免疫應答的主要細胞,在免疫調(diào)節(jié)和維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面具有重要的作用,它能吞噬和殺滅侵入的微生物,傳遞抗原,調(diào)節(jié)T細胞應答。巨噬細胞的分化、生存對免疫應答的深度至關(guān)重要〔1〕。越來越多的研究報道傷寒沙門菌可以引起吞噬細胞的凋亡,從而逃脫機體免疫系統(tǒng)的識別〔1-3〕,導致細菌在機體造成持續(xù)感染。

圖4 傷寒沙門菌誘導巨噬細胞8h TNF-α產(chǎn)生量(ni=6,±s)與對照組比較:*P＜0.01;Fig.4 TNF-α(pg/mL)in the culture supernatants of macrophages infected with Salmonella typhi after 8 hours compared to control:*P＜0.01

本實驗將傷寒沙門菌與巨噬細胞共培養(yǎng),采用Annexin V-FITC染色、流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)傷寒沙門菌可以誘導巨噬細胞凋亡,且細胞凋亡可被caspase3和caspase8抑制劑及TNF-α抗體不同程度的抑制(P＜0.01),細菌感染組作用 8h后caspase3,caspase8及 TNF-α和NO含量均較對照組升高(P＜0.01),說明這些因子都參與傷寒沙門菌誘導巨噬細胞凋亡,caspase9抑制劑未能抑制傷寒沙門菌誘導的細胞凋亡,這與檢測caspase9含量未見升高結(jié)果一致,說明caspase9未能參與傷寒沙門菌誘導的巨噬細胞凋亡。

經(jīng)典的細胞凋亡途徑有兩條,分別為細胞外途徑(細胞表面受體死亡途徑)和細胞內(nèi)途徑(線粒體引發(fā)途徑)。在細胞外途徑中,死亡信號的傳導依賴于死亡配體與受體的接合(如TNF-α與TNFR的結(jié)合),進一步激活caspase-8,使線粒體釋放細胞色素C或直接作用于caspase-3及其它下游的caspase。在細胞內(nèi)途徑中,細胞內(nèi)的死亡信號如DNA損傷、毒素和ATP耗竭等均可誘發(fā)線粒體釋放細胞色素C,進一步順序激活caspase-9、caspase-3、7等而誘發(fā)細胞凋亡〔4-5〕。

在革蘭陰性菌內(nèi)毒素脂多糖誘導巨噬細胞凋亡中,NO發(fā)揮重要作用。有報道細菌內(nèi)毒素可引起小鼠灌洗液中NO2-/NO3-濃度顯著增加,用一氧化氮合成酶抑制劑能阻斷上述反應,提示NO的合成增加在巨噬細胞的凋亡中起到重要作用〔6〕。本實驗研究發(fā)現(xiàn)傷寒沙門菌誘導巨噬細胞產(chǎn)生的NO濃度維持在較高水平,明顯高于對照組,有研究表明NO可以增加caspase3的活性〔7〕,活化的 caspase3可以水解caspase活化酶抑制劑,從而使caspase激活的DNA酶裂解DNA〔8〕,這與本實驗中caspase3活性增加導致細胞凋亡,加入caspase3抑制劑后凋亡有所下降的結(jié)果相一致。有報道TNF-α可引起不同類型細胞的凋亡〔9〕。Schuerwegh的研究發(fā)現(xiàn)在TNF-α誘導的牛軟骨細胞凋亡中 NO起重要作用〔10〕。在細胞凋亡中,TNF-α同 caspase3的關(guān)系同NO和caspase3的關(guān)系一樣得到證實〔11〕。Gup ta和Gollapudi發(fā)現(xiàn)在老年人體內(nèi)的 T細胞凋亡增加與 caspase3及 TNF-α表達有關(guān),在 TNF與TNF-α結(jié)合誘導免疫應答細胞凋亡時需要caspase3的活化〔12〕。本實驗中,TNF-α介導的凋亡同傷寒沙門菌感染相關(guān),采用抗人TNF-α抗體阻斷TNF-α后細胞凋亡率明顯下降,這與kim報道的結(jié)果相一致〔13〕。

總之,傷寒沙門菌可以誘導巨噬細胞凋亡,其凋亡機制可能是通過 TNF-α與其受體結(jié)合后激活NO和caspase3,caspase8介導的細胞外凋亡途徑,本研究結(jié)果有助于我們更好的理解傷寒沙門菌的致病機理,為我們進一步的診斷與治療提供了新的思路。

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