鄭惠能,李 莉,陳娟娟,黃仕杰,馬桂林,溫慧欣,沈理通,周常義,黃建煒

1972年Kapikian報(bào)道發(fā)現(xiàn)諾如病毒以來,越來越多的研究證實(shí)諾如病毒是急性胃腸炎暴發(fā)疫情最主要的病原,也是成人、兒童非菌性腹瀉主要的病原體。由于缺乏簡易、經(jīng)濟(jì)的檢測手段,臨床上尚難與其它病毒性腹瀉相鑒別,其所造成的疾病負(fù)擔(dān)并未引起人們足夠重視。為了解廈門地區(qū)諾如病毒的流行狀況,以便進(jìn)一步探索本地區(qū)諾如病毒流行規(guī)律和流行因素,為制訂防控對(duì)策提供依據(jù),本研究于2007年4月至2008年7月在3家哨點(diǎn)醫(yī)院開展監(jiān)測,收集了323例病毒性腹瀉患者糞便標(biāo)本,采用ELISA和realtime RT-PCR法檢測標(biāo)本中諾如病毒抗原和核酸,分析該人群諾如病毒感染狀況及特征。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 以廈門島內(nèi)的廈門市第一醫(yī)院和廈門市婦幼保健院以及島外的廈門市第三醫(yī)院為監(jiān)測哨點(diǎn)醫(yī)院,按監(jiān)測方案要求采集病毒性腹瀉病例糞便標(biāo)本。2007年4月至2008年7月共收集門診和住院病毒性腹瀉患者323例,采集糞便標(biāo)本10～15g/份,-70℃凍存。病毒性腹瀉病例定義為大便次數(shù)≥3次/d,呈水樣、蛋花樣或稀糊樣便,常規(guī)鏡檢WBC＜15,RBC=0,排除常見細(xì)菌、寄生蟲等感染的腹瀉病例。

糞便標(biāo)本諾如病毒抗原的ELISA檢測。應(yīng)用德國必發(fā)公司(R-Biopharm Rhone Ltd)第二代和第三代諾如病毒ELISA(RIDASCREEN Norovirus)試劑盒對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行諾如病毒抗原檢測。此試劑采用單克隆抗體夾心法,特異性檢測GGⅠ和GGⅡ組諾如病毒的共同抗原。凍存的糞便標(biāo)本溶解后,以試劑盒中的標(biāo)本稀釋液10倍稀釋,振蕩混勻、靜置10 min后,室溫5 000r/min離心5 min,取100μL上清液,按照試劑盒說明書檢測和判斷結(jié)果。

1.2 病毒RNA提取、檢測與分型 糞便標(biāo)本溶解后以生理鹽水10倍稀釋、振蕩混勻,10 000r/min離心 5min;取 140μL 上清液,按照 QIAamp Viral RNA Mini KIT的說明書要求以柱離心法提取總RNA,洗脫液為60μL。取 5μL RNA 提取液以深圳太太基因工程公司的諾沃克病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測病毒RNA。陽性標(biāo)本重提RNA后以上海之江諾如病毒熒光PCR(rRT-PCR)分型試劑盒(GGⅠ+Ⅱ)檢測。核酸擴(kuò)增使用ABI7500和Biometra PCR儀。

1.3 病毒型別的驗(yàn)證 隨機(jī)取5份GGⅡ組諾如病毒RNA陽性的標(biāo)本RNA提取液5μL,以QLAGEN OneStep RT-PCR KIT逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增病毒RdPd基因片段,引物序列為NVRPf 5'-ATACCACTATGATGCAGATTA-3'和NVRPr5'-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3',RT-PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖膠電泳,回收327bp條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物,以QIAquick Gel Extraction Kit純化后送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。獲得的序列與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫比對(duì),驗(yàn)證病毒的型別檢測結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 腹瀉病例糞便標(biāo)本的檢測結(jié)果 323例門診、住院的病毒性腹瀉患者糞便標(biāo)本,ELISA檢測諾如病毒抗原陽性68例,陽性率為21.05%,其中,2007年9月20日以前,使用德國必發(fā)公司第二代諾如病毒ELISA試劑盒檢測159例,陽性20例,陽性率12.58%;2007年9月20日以后,使用該廠家的第三代ELISA試劑盒檢測164例,陽性48例,陽性率29.27%。323例患者糞便標(biāo)本RT-PCR檢測諾如病毒RNA陽性107例,陽性率為33.13%;抗原和RNA雙陽性52例,抗原或RNA任一項(xiàng)陽性共123例,諾如病毒檢出率為38.08%(123/323)。見表1。

2.2 諾如病毒感染病例分布特征 城市居民病毒性腹瀉患者諾如病毒檢出率為37.12%,農(nóng)村患者檢出率為40.43%,兩者無顯著性差異(χ2=0.31,P=0.5787);男性患者諾如病毒檢出率為34.41%,女性患者檢出率為38.59%,兩者無顯著性差異(χ2=0.05,P=0.8295);廈門島內(nèi)居民與島外居民病毒性腹瀉患者的諾如病毒檢出率分別為32.63%和45.86%,島外患者檢出率高于島內(nèi)患者(χ2=5.79,P=0.0161);門診與住院病例諾如病毒檢出率分別為42.68%和25.30%,門診病例檢出率明顯高于住院病例(χ2=7.71,P=0.0055)。

全年都有感染病例,以1、2月份諾如病毒檢出率最高,分別為66.67%和70%。諾如病毒感染患者年齡最小為21日齡,最大為83歲。1歲以下嬰兒腹瀉病例諾如病毒檢出率達(dá)27.50%;20歲至60歲組成人患者檢出率為40%～50%。各年齡組的病毒性胃腸炎患者諾如病毒檢出情況見表2。

2.3 病毒型別與驗(yàn)證 PCR陽性標(biāo)本的型別組成:諾如病毒 GGⅡ80份(74.77%)、GGⅠ2份(1.87%)、未定型25份(23.36%)。

隨機(jī)選取的5份NoV RNA陽性標(biāo)本測序獲得的序列完全相同,其中329bp堿基見下圖,與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫比對(duì),屬于GGⅡ。如,糞便標(biāo)本251的病毒核酸片段序列與GenBank Norovirus Hu/Duan/Beijing/2006/China比較,片段序列相似度99%(325/328),同屬GGⅡ。

圖1 糞便標(biāo)本251諾如病毒基因與Norovirus Hu/Duan/Beijing/2006/China的片段序列比較Fig.1 Fecal samples RNA sequence comparisonsbetween 251 Norovirusgeneand NorovirusHu/Duan/Beijing/2006/China

3 討 論

諾如病毒在世界各地都有廣泛的傳播。早年應(yīng)用電鏡和免疫電鏡檢測諾如病毒,但電鏡檢測方法靈敏度低,且受操作者影響較大,因此檢出率較低。1992年后發(fā)展并使用RT-PCR方法檢測諾如病毒,Frankhauser等在美國33個(gè)州1996年1月至1997年6月發(fā)生的90起非菌性急性胃腸炎暴發(fā)中發(fā)現(xiàn)96%的病原為諾如病毒〔1〕,荷蘭、英國、日本和澳大利亞的研究也證實(shí)了諾如病毒是引起急性胃腸炎暴發(fā)的最主要病原〔2-3〕。方肇寅等對(duì)我國長春、北京、福州等13個(gè)地區(qū)1999-2005年5歲以下腹瀉患兒輪狀病毒陰性的糞便標(biāo)本用ELISA和RT-PCR方法檢測人類杯狀病毒(HuCV),結(jié)果顯示,HuCV陽性率 19%(8.3%～38.6%),其中諾如病毒占96.7%,絕大多數(shù)毒株為GG Ⅱ(92.47%)〔3〕。高志勇等報(bào)道北京地區(qū)病毒性胃腸炎患者諾如病毒檢出率為 38.89%,97.14%為 GG Ⅱ〔4〕。

表1 各月份NoV病毒檢測結(jié)果Table 1 NoV test results of different months in 2007 and 2008

表2 各年齡組NoV檢測結(jié)果Table 2 NoV test results of different age subgroup

本研究顯示,廈門地區(qū)病毒性腹瀉患者諾如病毒檢出率為 38.08%,流行優(yōu)勢株為 GGⅡ(74.77%),與國內(nèi)研究結(jié)果基本相符。各年齡組均可感染諾如病毒,但以20-60歲組患者感染率最高,達(dá)40%～50%;全年均可檢出諾如病毒感染,以冬春季的1、2月份為高峰,檢出率分別達(dá)66.67%和70%,提示本地區(qū)1-2月可能為諾如病毒流行高峰。門診與住院病例諾如病毒檢出率分別為42.68%和25.30%,估計(jì)是由于諾如病毒性腹瀉癥狀比輪狀病毒性腹瀉輕,住院患者一般癥狀較重,輪狀病毒檢出率高,諾如病毒檢出率低,在門診患者中情況則相反。40例1歲以下病毒性腹瀉患兒(住院36例、門診4例),諾如病毒的檢出率達(dá)27.50%,住院患兒檢出率為27.78%(10/36),雖然未進(jìn)一步排除輪狀病毒、札如病毒、腸道腺病毒等其他腸道病毒感染所致,但提示諾如病毒乃為本地區(qū)嬰兒腹瀉的重要病原,在嬰幼兒冬春季腹瀉臨床診斷和治療中,除輪狀病毒外還應(yīng)關(guān)注諾如病毒感染。

本研究還顯示,廈門城市與農(nóng)村地區(qū)的病毒性腹瀉患者諾如病毒感染無顯著性差異,可能與幾年來廈門地區(qū)的城市化建設(shè)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展縮小了城鄉(xiāng)居民在生活水平與享有衛(wèi)生服務(wù)之間的差距有關(guān)。而廈門島內(nèi)的病毒性腹瀉患者諾如病毒感染率比島外的低的研究結(jié)果,則可能與廈門島內(nèi)居民的文化程度、經(jīng)濟(jì)條件、個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣以及島內(nèi)良好的衛(wèi)生環(huán)境、城市基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)、衛(wèi)生城市管理等有密切關(guān)聯(lián),對(duì)其影響因素有待進(jìn)一步研究,它將有助于科學(xué)制定防控策略和更有針對(duì)性的防控措施。

〔1〕Fankhauser RL,Noel JS,Monroe SS,et al.Molecular epidemiology of“Norwalk like viruses” in outbreaks of gastroeneuritis in the United States〔J〕.J Journal of Infect Disease,1998,178:1571-1578.

〔2〕Reuter G,Farkas T,Berke T ,et al.Molecular epidemiology of human calicivirus gastroenteritis outbreaks in Hungary,1998 to 2000〔J〕.J Med Virol,2002,68(3):390-398.

〔3〕方肇寅,謝華萍,呂紅霞,等,1999-2005年我國嬰幼兒人杯狀病毒腹瀉研究〔J〕,病毒學(xué)報(bào),2007,23(1):9-15.

〔4〕高志勇,呂虹,黃芳,等,90例病毒性胃腸炎患者糞便中諾如病毒檢出情況分析〔J〕,中國病原生物學(xué)雜志,2008,3(8):564-567.